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第一件事：質(zhì)譜可以檢測蛋白類藥物嗎？
隨著蛋白類藥物研發(fā)的快速發(fā)展，其檢測需求也日趨增多。免疫分析法是檢測該類藥物的常規(guī)方法，其具有靈敏度高和專屬性強等優(yōu)點，但也存在一定的局限性，比如相對較窄的線性范圍，方法精密度和重現(xiàn)性相對不佳，以及較大的基質(zhì)干擾，這些在一定程度上影響了蛋白類藥物檢測的準確性。由于蛋白類藥物分子量遠遠超過質(zhì)譜分析儀器的質(zhì)荷比檢測上限，因此不能直接對該類藥物進行檢測。目前常規(guī)方法主要是通過將蛋白類藥物變性、還原、烷基化，然后使用蛋白酶裂解，形成特征性的肽段，這些肽段具有良好的色譜和電離特性，幾乎無復雜的氨基酸殘基或修飾，能夠呈現(xiàn)線性和精確的響應。
第二件事：哪些蛋白類藥物可以使用質(zhì)譜檢測？
蛋白質(zhì)的基本結構單元是氨基酸，構成天然蛋白質(zhì)的氨基酸有20多種。蛋白質(zhì)結構中化學鍵包括共價鍵與非共價鍵，共價鍵有肽鍵和二硫鍵，非共價鍵有氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力與配位鍵等。蛋白質(zhì)的結構可分為一、二、三、四級結構，一級結構為初級結構，二、三、四級結構為高級結構或空間結構。蛋白質(zhì)的化學降解與溫度、pH值、離子強度和氧化劑的存在等密切相關，也與蛋白質(zhì)的結構與性質(zhì)有關。蛋白類藥物主要分為四類：
第一類：應用蛋白質(zhì)的酶活性及調(diào)節(jié)活性進行治療的蛋白質(zhì)藥物。該類藥物多為功能活性明確、作用位點清楚的蛋白分子。目前已經(jīng)上市的非抗體類重組 蛋白質(zhì)藥物均屬于此 類，可 細 分 為 以 下３組：
ａ）替代缺乏或異常的蛋白質(zhì)：因為許多疾病是由于特定的蛋白缺乏或異常引起的。本組藥物通過持續(xù)給予該蛋白，治療由確定的分子病因?qū)W造成的內(nèi)分泌及代謝性疾病，如治療由于激素缺乏的胰島素、生長激素等。
ｂ）增強蛋白質(zhì)生物活性通路的藥物：主要通過增強血液或內(nèi)分泌通路或增強免疫反應來達到治療作用。本組藥物主要為人體 內(nèi)正常情況下存在的細胞因子、內(nèi)分泌激素、凝血酶類分子或它們的類似物等，具有微量強效、作用快速等特點。
ｃ）提供新功能或新活性的蛋白藥物：使用天然存在的蛋白質(zhì)來治療人類病理生理學疾病，如對大分子酶促降解的膠原酶、透明質(zhì)酸酶和阿法鏈道酶，對小分子代謝物酶促降解的PEG修飾。
第二類：有特殊靶向活性的蛋白質(zhì)治療藥物。本類藥物以單克隆抗體、免疫球蛋白相關分子為主。
ａ）直接干擾靶分子或靶組織功能的蛋白。主要是各種治療性抗體，如利妥昔單抗、曲妥珠單抗、貝伐單抗、英夫利昔單抗、阿達木單抗等。
ｂ）傳遞其他化合物的藥物：該類藥物利用蛋白質(zhì)可特異性結合治療靶點的能力，借助蛋白質(zhì)為傳輸載體，將高毒性的小分子藥物、毒素或同位素等效應分子靶向運送至疾病部位 從 而 發(fā) 揮 治 療作用。
第三類：蛋白或多肽疫苗。伴隨蛋白或多肽疫苗制造技術的發(fā)展，“治療性疫苗”的理論及應用不斷成熟，從本質(zhì)上改變了傳統(tǒng)疫苗的概念。無論從研發(fā)手段、生產(chǎn)工藝，還是從產(chǎn)品標準、質(zhì)量控制等角度，蛋白或多肽疫苗與蛋白質(zhì)藥物已經(jīng)沒有區(qū)別。因此將蛋白或多肽疫苗歸為蛋白質(zhì)藥物范疇是一種必然趨勢。
第四類：用于診斷的重組蛋白質(zhì)藥物。該類重組蛋白質(zhì)藥物兼有藥物及診斷試劑的雙重功能，可用于某些特定疾病的體外及體內(nèi)診斷，如腫瘤顯像劑多用抗體偶聯(lián)同位素，在腫瘤 定位診斷的同時，同位素也可能對瘤細胞發(fā)揮抑制或殺傷作用。
第三件事：與傳統(tǒng)配體結合方法（Ligand binding assay ，LBA）比較，質(zhì)譜技術有哪些優(yōu)勢？
經(jīng)典的蛋白質(zhì)藥物定量分析采用LBA技術，其中以酶聯(lián)免疫吸附實驗法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）為代表，該技術的主要優(yōu)點是對儀器設備要求低、易于操 作以及靈敏度高。但是也存在一定的缺點，例如：方法建立時間長、受內(nèi)源性抗體的干擾、定量范圍窄、非特異性結合以及交叉免疫等。近年來備受關注的質(zhì)譜技術，在蛋白藥物定量分析中，具有良好的選擇性、準確性、精確性、定量范圍寬、開發(fā)時間短（約幾周時間）、分析通量高以及多重分析能力的優(yōu)點。與 LBA方法相比，質(zhì)譜技術的優(yōu)點主要體現(xiàn)在以下幾點：
第一，質(zhì)譜方法開發(fā)的步驟包括質(zhì)譜和液相方法的建立、樣品的前處理、方法學驗證，這些步驟耗時短，一般只需要2-4周，耗費成本也低。相反，LBA方法開發(fā)的步驟包括關鍵試劑的優(yōu)化、內(nèi)源性干擾物質(zhì)的檢查、不同來源樣品的交叉驗證。建立LBA方法需要開發(fā)關鍵試劑，要耗費大量的時間，而且耗費成本較高。
第二，質(zhì)譜方法使用同位素標記的肽段或蛋白質(zhì)作為內(nèi)標，可以有效地校正分析過程中的偏差和基質(zhì)效應。只要正確的維護儀器和執(zhí)行相關的質(zhì)量控制標準，質(zhì)譜方法是非常穩(wěn)定，而LBA的關鍵試劑都是通過生物過程產(chǎn)生的，容易受到蛋白質(zhì)翻譯后修飾等因素的 干擾，而且LBA方法難以使用內(nèi)標來糾正定量偏差，很難保持較高的批間／實驗室間的一致性。
第三，質(zhì)譜方法通過色譜分離和同位素標記內(nèi)標物的校正可以最大程度地降低基質(zhì)效應的影響，并且能夠適用于不同的生物基質(zhì)，因此可以同時開發(fā)出應用于不同組織和器官的方法，用以定量其中藥物濃度。相反，LBA方法很難應用在不同的基質(zhì)（血漿或組織）以及不同的物種之間，不同的基質(zhì)成分引起的干擾和交叉反應非常明顯，對LBA的特異性有很大的影響。
最后，質(zhì)譜可以同時檢測多個待測物，特異性強，能很好的避免基質(zhì)干擾，特別適用于一些受到內(nèi)源干擾很強的項目，此外，還擁有較寬的線性范圍。而LBA一般很難同時檢測多個待測物，線性范圍也相對較窄，也易受到內(nèi)源干擾的影響。
第四件事：質(zhì)譜檢測蛋白類藥物的一般步驟有哪些？
如圖1所示，目前常規(guī)的方法主要是通過將蛋白類藥物變性、還原、烷基化，使用蛋白酶裂解以形成特征性的肽段，最后篩選響應高、干擾低的特異性肽段進行檢測。由于蛋白類藥物多重的空間結構，需要進行打開空間結構。常見的變性方式主要有高溫、添加有機試劑、強酸、鹽類以及其他的蛋白質(zhì)變性劑。此處特別注意添加變性劑對于后續(xù)蛋白酶活性的影響。蛋白類藥物結構中含有二硫鍵，需要打開二硫鍵和保護巰基避免二聚體形成。常規(guī)的還原試劑包括DTT和TCEP，烷基化試劑包括碘乙酰胺。這里需要關注反應條件（pH和溫度）。酶解過程是蛋白質(zhì)藥物檢測最關鍵的步驟，大部分藥物都可以使用胰蛋白酶進行酶解，主要作用賴氨酸和精氨酸的羧基端。酶解產(chǎn)生很多片段我們需要同蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選出特異性片段，一般選擇可變區(qū)域的片段作為候選肽段。
圖1
第五件事：有質(zhì)譜檢測蛋白類藥物成功的案例？
目前熙寧生物質(zhì)譜平臺基于LC-MS已開發(fā)出檢測英夫利西單抗、新冠中和抗體、帕博利珠單抗等蛋白質(zhì)類藥物的方法，并成功應用臨床樣品檢測。實驗數(shù)據(jù)表明，質(zhì)譜檢測蛋白類藥物擁有非常高的精密度、準確度和重現(xiàn)性，且臨床試驗樣品再分析（ISR）結果高達99%以上，體現(xiàn)出特別出色的方法可靠性。
結束語
熙寧生物質(zhì)譜平臺能夠提供符合NMPA/FDA/OECD/EMA的各項生物樣品分析服務，支持小分子藥物、多肽、寡核苷酸、PROTAC、ADC以及大分子抗體等藥物的方法開發(fā)、驗證和樣品檢測。平臺配備了多套高端液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和Watson LIMS在內(nèi)的生物分析系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)，各種先進輔助設備，不僅可以滿足各型實驗的檢測需求，還大大提高實驗效率和質(zhì)量，更高效地幫助客戶完成藥品研發(fā)。
參考文獻：
1. Fu Wei, Chen Qian, An Bo. Qualitative and quantitative characterization of protein biotherapeutics with liquid chromatography mass spectrometry[J]. Chin Hosp Pharm. 2019 Aug;39(16):1703-1708.
