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小干擾RNA(small interfering RNA; siRNA)屬于小核酸藥物中重要的一種藥物類型，也被稱為短干擾RNA(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是長度在20到25個核苷酸的雙鏈RNA，在生物學(xué)上有許多不同的用途。
其結(jié)構(gòu)如圖1a所示，雙鏈RNA由正義鏈和反義鏈組成，在3‘端有兩個堿基的游離，未經(jīng)修飾的siRNA在體內(nèi)很快被降解，目前主要采用納米遞送系統(tǒng)（圖1b）或者設(shè)計成GalNAc（乙酰半乳糖胺）-siRNA復(fù)合物（圖1c）。SiRNA藥物作用機(jī)理如圖2所示，siRNA片段與RISC（RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體）結(jié)合，RISC由Argonaute-2 （Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-結(jié)合蛋白（TRBP）組成，然后RNA的兩條鏈分開，其中一條鏈從復(fù)合物上分離，5'端雙鏈穩(wěn)定性最低的那條鏈被選擇出來，穩(wěn)定的并入沉默復(fù)合物中，可激活RNA干擾，與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)序列特異性結(jié)合實現(xiàn)mRNA降解。如圖3所示，目前全球已上市5款siRNA藥物，中國大陸暫無siRNA 藥物上市，大多處于均臨床和臨床前研究階段。
圖1a
Lipid polymer NPs
圖1b
圖1c
圖2
圖3
基于LC-MS檢測siRNA有諸多難點，比如化合物極性大，色譜保留弱，此外siRNA藥物為雙鏈結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)行雙鏈解鏈，檢測單鏈濃度，因此需要將正義鏈和反義鏈在色譜保留上盡量分離，降低雙鏈相互干擾的影響；由于藥物容易被限制性核酸內(nèi)切酶降解，因此需要重點關(guān)注穩(wěn)定性問題。
在質(zhì)譜檢測方面，由于其檢測局限性，對于分子量較大的siRNA藥物，一般以多電荷形式呈現(xiàn)，此外強(qiáng)酸性化合物需要在負(fù)離子模式下進(jìn)行，該藥物還易與金屬離子螯合，諸多因素導(dǎo)致了LC-MS檢測siRNA在靈敏度方面具有巨大的挑戰(zhàn)。常規(guī)的樣品前處理（蛋白質(zhì)沉淀、液液萃取、固相萃取）方法不能適用于siRNA藥物提取，因此需要在提高提取回收率、前處理效率和結(jié)果重現(xiàn)性做出更多的努力，下面總結(jié)了相關(guān)實驗內(nèi)容。
一、 前處理
本實驗采用液液萃取方法，如圖4，該方法前處理簡單，耗時短，重現(xiàn)性好，成本低廉，非常適合高通量的樣品前處理。實驗操作需在冰浴黃光下操作保證樣品中待測物穩(wěn)定性。
圖4
二、線性、精密度和準(zhǔn)確度
本實驗線性范圍為正義鏈5~2500 ng/mL，反義鏈5~2500 ng/mL，代表性標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5a（正義鏈）和圖5b（反義鏈），相關(guān)系數(shù)均r＞0.999。表明線性關(guān)系良好。
通過考察3個分析批，5個濃度質(zhì)控樣品，用以評估該方法的精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度（含LLOQ QC的所有濃度質(zhì)控）準(zhǔn)確度偏差范圍為-7.6~10.1%、-8.5~9.3%，%CV最大值分別為7.3%、6.4%；批間精密度和準(zhǔn)確度（含LLOQ QC的所有濃度質(zhì)控）準(zhǔn)確度偏差范圍為-5.0~6.7%、-6.3~8.3%，%CV最大值為5.0 %、5.4%。
圖5a
圖5b
三、選擇性
選擇性考察不同來源的空白基質(zhì)以及高脂，溶血基質(zhì)，評估空白基質(zhì)對待測物和內(nèi)標(biāo)的干擾。同時考察了內(nèi)標(biāo)對待測物的干擾，圖6a為空白基質(zhì)圖譜，圖6b為定量下限和內(nèi)標(biāo)圖譜。
圖6a
圖6b
此外本實驗同時考察了不同個體間基質(zhì)效應(yīng)，高脂溶血基質(zhì)效應(yīng)，提取回收率、全血穩(wěn)定性，以及基質(zhì)中穩(wěn)定性，包含短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性、處理后樣品穩(wěn)定性等，所有驗證項目均滿足接受標(biāo)準(zhǔn)后，表明該方法能用于后續(xù)的臨床樣品分析。siRNA質(zhì)譜檢測存在較大的技術(shù)挑戰(zhàn)，若對該檢測內(nèi)容非常感興趣可以關(guān)注熙寧生物于2023年02月23日進(jìn)行的寡核苷酸藥物質(zhì)譜檢測生物分析策略的視頻直播回放，相信經(jīng)過這場直播將會讓您對該類型藥物檢測有更多的了解，解答心中的諸多疑惑。
四、結(jié)束語
熙寧生物質(zhì)譜平臺能夠提供符合NMPA/FDA/OECD/EMA的各項生物樣品分析服務(wù)，支持小分子藥物、多肽、寡核苷酸、PROTAC以及ADC等大分子藥物的方法開發(fā)、驗證和樣品檢測。平臺配備了多套高端液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和Watson LIMS在內(nèi)的生物分析系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)以及各種先進(jìn)輔助設(shè)備，可以滿足各類型藥物臨床試驗的檢測需求，極大提高了實驗效率和質(zhì)量，更高效地幫助客戶進(jìn)行藥品研發(fā)。
