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流式細(xì)胞術(shù)的受體占有率（receptor occupancy，RO）分析是一種穩(wěn)健的分析方法，旨在識(shí)別、量化和監(jiān)測(cè)治療藥物與其靶點(diǎn)的結(jié)合。眾所周知，在藥物臨床研究中，RO分析可輔助劑量設(shè)定、幫助評(píng)估生物制劑最小生物效應(yīng)水平、合理劑量并建立合理給藥方案。RO分析可用于安全性評(píng)估，評(píng)估長(zhǎng)期飽和RO導(dǎo)致的毒副作用的可能性。RO通常被視為藥效學(xué)（PD）指標(biāo)，與藥代動(dòng)力學(xué)（PK）評(píng)估相結(jié)合，用于建模PK/PD關(guān)系，是作用于細(xì)胞表面靶點(diǎn)的大分子藥物PK/PD建模的基石。通常在設(shè)計(jì)RO的實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要考慮很多因素，如測(cè)試樣本的種類和條件，檢測(cè)試劑的特異性及檢測(cè)濃度的確認(rèn)，受體表達(dá)的水平和靶細(xì)胞的豐度，靶點(diǎn)在給藥過(guò)程中表達(dá)水平的變化和ADA的存在對(duì)RO檢測(cè)的影響等等。隨著新型雙特異性(BsAbs)和三特異性(TsAbs)療法的發(fā)展，它們可以識(shí)別兩到三個(gè)獨(dú)特的表位，需要更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)確保RO的正確評(píng)估。
RO檢測(cè)模式和檢測(cè)原理
RO試驗(yàn)，一般涉及三個(gè)類型（如圖1所示）：“結(jié)合受體” 、“游離受體”及”總受體”，基于這三個(gè)類型，目前常用受體占有率的檢測(cè)主要有兩種模式：一種是通過(guò)檢測(cè)結(jié)合的受體和總受體水平，計(jì)算受體占有率，通常稱為“結(jié)合”模式；另一種是通過(guò)檢測(cè)游離受體和總受體水平，計(jì)算受體占有率，通常稱為“游離”模式。采用響應(yīng)信號(hào)值（主要包括平均熒光強(qiáng)度、中位熒光強(qiáng)度和百分比等）作為報(bào)告值和計(jì)算依據(jù)。 “游離”和“結(jié)合”的分析模式及其許多變體模式已經(jīng)廣泛用于臨床前、臨床開(kāi)發(fā)和上市后研究，這說(shuō)明了這些分析在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中的重要性和實(shí)用性。
圖1. RO的3種基本形式
雙/三特異性抗體受體占位分析方案設(shè)計(jì)考量
對(duì)于雙/三抗治療藥物的受體占位檢測(cè)，若不區(qū)分受體，可采用 “結(jié)合”模式進(jìn)行檢測(cè)（如圖2所示），“結(jié)合受體”需使用熒光素標(biāo)記或者生物素標(biāo)記的藥物的特異性抗體來(lái)檢測(cè)，”總受體”檢測(cè)一般需要加入過(guò)量的藥物飽和受體，然后使用熒光素標(biāo)記或者生物素標(biāo)記的藥物的特異性抗體來(lái)檢測(cè)；
圖2. “結(jié)合”模式總受體檢測(cè)原理
若區(qū)分受體，采用雙抗藥物過(guò)飽和測(cè)總受體的方法是不可取的，因其可與兩/三個(gè)受體結(jié)合，因此沒(méi)法確定某一受體的表達(dá)量。因此對(duì)于雙/三抗區(qū)分受體的檢測(cè)，“游離”模式可能是唯一的選擇，需要考量的因素主要有：
（1） “游離受體”檢測(cè)一般使用熒光素標(biāo)記的藥物，或者生物素標(biāo)記的藥物，配合熒光素標(biāo)記的鏈霉親和素使用（如圖3所示）。熒光素標(biāo)記或者生物素標(biāo)記抗體或者蛋白是實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)操作，僅需要很少的資源即可獲得。其質(zhì)量和穩(wěn)定性可靠，可獲得足夠的量，并且明確可與藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體。
“游離受體”檢測(cè)也可采用與藥物競(jìng)爭(zhēng)且親和力相當(dāng)或低于藥物與受體結(jié)合親和力的競(jìng)爭(zhēng)性抗體（非熒光素標(biāo)記的藥物）來(lái)檢測(cè)，即結(jié)合同一受體的相同表位（如圖3所示）。前提是篩到這樣的抗體，相對(duì)于用熒光素標(biāo)記藥物檢測(cè)的方法，該方法人力成本和試劑成本都要高一些，因此第一種方式是比較容易實(shí)現(xiàn)的，開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證一種檢測(cè)方法，具備較高的成本優(yōu)勢(shì)。
圖3. “游離”模式檢測(cè)原理
對(duì)于可逆結(jié)合的靶點(diǎn)，隨著檢測(cè)抗體濃度不斷增加，藥物與靶點(diǎn)間存在競(jìng)爭(zhēng)置換的可能，因此需要對(duì)檢測(cè)抗體的濃度進(jìn)行充分摸索，以尋找最優(yōu)檢測(cè)抗體濃度（如圖4所示）。
圖4. 檢測(cè)抗體的滴定
（2）”總受體”的檢測(cè)，采用非競(jìng)爭(zhēng)抗體來(lái)檢測(cè)。非競(jìng)爭(zhēng)抗體，即一種與藥物結(jié)合同一受體，又與藥物互不干擾的檢測(cè)抗體。實(shí)際工作中，尋找商業(yè)化的可用的非競(jìng)爭(zhēng)性試劑來(lái)評(píng)估總受體是有一定難度的，需要花費(fèi)很多的時(shí)間和財(cái)力，甚至可能找不到這樣的試劑。若是未篩選到藥物的非競(jìng)爭(zhēng)性抗體，總受體檢測(cè)可以對(duì)給藥前的樣本進(jìn)行藥物的過(guò)飽和處理測(cè)得總受體水平，但由于受體/靶點(diǎn)在給藥過(guò)程中，可能會(huì)發(fā)生受體/靶點(diǎn)上調(diào)或下調(diào)（內(nèi)化或脫落等），給藥后受體的表達(dá)水平發(fā)生變化（如圖5所示），可能會(huì)高估或低估RO。另外，如果對(duì)于一些表達(dá)豐度比較低的受體，無(wú)法通過(guò)圈門得出陽(yáng)性比例，只能通過(guò)平均熒光強(qiáng)度（MFI）或熒光強(qiáng)度中位值（MdFI）計(jì)算得到給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的RO，而這兩個(gè)值會(huì)受儀器狀態(tài)、設(shè)置、分析人員和實(shí)驗(yàn)室等影響，因此測(cè)定的給藥前總受體水平在一定程度上可能不能真實(shí)反饋實(shí)際給藥后的總受體水平。
圖5. 給藥后受體調(diào)節(jié)機(jī)制
（3） “自由模式”容易受到ADA和Nab的影響，尤其是使用全血進(jìn)行RO檢測(cè)時(shí)。如下圖6所示，由于有Nab的產(chǎn)生，加入的檢測(cè)試劑被Nab識(shí)別中和，因此不能結(jié)合到受體上，最后造成過(guò)高的估計(jì)藥物的RO水平。而圖7指的是另外一種情況，由于存在ADA，ADA與藥物結(jié)合，進(jìn)而ADA的另外一端可以和標(biāo)記的藥物結(jié)合，或者ADA兩端都可以和標(biāo)記的藥物結(jié)合，造成信號(hào)放大，造成過(guò)低的估計(jì)藥物RO水平，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用與藥物分子沒(méi)有同源序列但與藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體的抗體或許可以避免這個(gè)問(wèn)題。
圖6. 中和的ADA可能對(duì)RO檢測(cè)造成的影響
圖7. 非中和的ADA可能對(duì)RO檢測(cè)造成的影響
案例分享
熙寧生物有著豐富的基于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雙/三特異性抗體受體占位的臨床項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，開(kāi)發(fā)了多個(gè)雙/三特異性抗體藥的受體占位檢測(cè)方法，部分項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)如下：
1.某雙抗藥物檢測(cè)試劑濃度摸索的部分?jǐn)?shù)據(jù)：
圖8 A. 受體A檢測(cè)試劑濃度滴定
圖8 B. 受體B檢測(cè)試劑濃度滴定
圖8是某雙抗藥物的受體占位檢測(cè)試劑濃度滴定的數(shù)據(jù)，從圖上可以看出，對(duì)于受體A，檢測(cè)抗體與藥物競(jìng)爭(zhēng)不明顯，可以用于檢測(cè)游離受體；對(duì)于受體B，檢測(cè)抗體與藥物競(jìng)爭(zhēng)明顯，不能用于檢測(cè)游離受體。
表1 受體A RO%穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
表2 受體B RO%穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
表3 受體A和受體B的總的RO%的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
表1、2和3中，由于兩個(gè)受體的表達(dá)豐度不一樣，表中HQC和LQC不能通用，分開(kāi)配制，加藥濃度根據(jù)不同檢測(cè)項(xiàng)有所調(diào)整。HQC和LQC樣品在2-8℃保存9天，均滿足接受標(biāo)準(zhǔn)CV≤30%。
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