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蛋白生物標(biāo)志物的檢測為患者提供了重要的臨床信息，為診斷、預(yù)后和藥效學(xué)提供指導(dǎo)。目前，常見蛋白生物標(biāo)志物檢測使用的體液樣本（基質(zhì)）包括血清、血漿（含不同類型的抗凝劑）、尿液、腦脊液、細(xì)胞裂解液、糞便等。檢測時，基質(zhì)的不同會影響分析的準(zhǔn)確性和結(jié)果的可靠性，但在藥物開發(fā)階段，人們經(jīng)常是根據(jù)以往的經(jīng)驗或文獻進行基質(zhì)選擇，往往會忽視基質(zhì)對蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物定量檢測的影響，未充分了解不同基質(zhì)間的差異。
本文淺談蛋白生物標(biāo)志物在不同基質(zhì)中的差異以及影響因素，為蛋白生物標(biāo)志物檢測的基質(zhì)選擇提供建議。
1.基于檢測目的進行基質(zhì)選擇
臨床檢測中，應(yīng)根據(jù)不同的生物標(biāo)志物檢測目的來選擇不同的基質(zhì)。
血清和血漿是最常用的蛋白生物標(biāo)志物檢測基質(zhì)。血清是凝血反應(yīng)后的上層淡黃色透明液體（圖1）。在凝血反應(yīng)中，纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，血清中不再含有纖維蛋白原，也不含血小板，具有少量的凝血因子和因凝血產(chǎn)生的代謝物。血漿是血液從體內(nèi)取出后，加入抗凝劑進行離心后得到的上層液體（圖1）?？鼓齽┑拇嬖谧钄嗔四?zhǔn)椒磻?yīng)，使凝血過程受阻，因此血漿中還存在纖維蛋白原。市面上最為常見的抗凝劑包括乙二胺四乙酸（EDTA）、肝素、檸檬酸鈉（又名枸櫞酸）等。另外，CTAD（含檸檬酸、茶堿、腺苷和潘生丁的抗凝采血管）也常常被使用。這些抗凝劑可以防止血小板的活化和凝血的產(chǎn)生?？傮w而言，血清和血漿樣本可用于各類細(xì)胞因子、趨化因子等蛋白生物標(biāo)志物的檢測。另外，血清樣本還可用于各種病毒抗體的檢查，包括丙肝病毒抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒抗體檢查以及腫瘤標(biāo)記物等。血漿樣本還可用于檢查凝血酶的情況，通過凝血酶原時間來判斷用藥的劑量以及效果等。
尿液檢查可以檢查紅細(xì)胞、白細(xì)胞和尿蛋白、尿糖、尿膽紅素、HCG值等指標(biāo)，從而判斷是否患有腎臟類疾病、是否存在泌尿系統(tǒng)疾病、是否血糖血壓正常、是否懷孕等情況。此外檢測尿液中的尿核基質(zhì)蛋白NMP22可用來輔助診斷膀胱癌。作為核基質(zhì)蛋白家族成員，NMP22在癌性尿路上皮細(xì)胞中表達(dá)量豐富，在惡性細(xì)胞凋亡后釋放到尿液中，導(dǎo)致濃度高于良性條件。
腦脊液（Cerebro-Spinal Fluid，CSF）為無色透明的液體，充滿在各腦室、蛛網(wǎng)膜下腔和脊髓中央管內(nèi)。腦脊液由腦室中的脈絡(luò)叢產(chǎn)生，與血漿和淋巴液性質(zhì)相似，略帶粘性。臨床上常使用腰椎穿刺術(shù)進行腦脊液抽取。腦脊液的檢查對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷有著重要的作用，例如阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）通過檢測腦脊液的β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）、總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的含量來進行診斷。
綜上所述，在臨床檢測中，需要根據(jù)檢測目的使用不同的基質(zhì)。在藥物開發(fā)前期研究中，血清或血漿樣本更易獲得、能更直觀體現(xiàn)藥效等，因此成為使用和研究最多的生物標(biāo)志物檢測基質(zhì)。
圖1 血漿與血清的區(qū)別
2.蛋白生物標(biāo)志物在血清與血漿中的差異
制備血清或者血漿時，需要將人體內(nèi)的血液抽取出來，此時的血管內(nèi)皮損傷，凝血程序被啟動，血小板將被激活。血小板為盤狀無核的細(xì)胞碎片，其相關(guān)蛋白質(zhì)超過5000個，其中超過1000個蛋白質(zhì)在血小板激活時釋放。這些蛋白質(zhì)分布在各種血小板顆粒中，包括致密顆粒、α顆粒和溶菌酶顆粒(例如表1示例)。
檢測血小板活化和顆粒的釋放，可以通過測量血小板內(nèi)的蛋白質(zhì)，如：ATP（致密顆粒）、血小板因子4、血管性血友病因子、人P選擇素（α顆粒）、水解酶（溶菌酶）。也可通過血小板活化后激活的其他標(biāo)記物來評估，如：表面人P選擇素(CD62p) 、血小板衍生微粒(PMP)、血小板-單核細(xì)胞聚集體(PMA)和可溶性人P選擇素。此外，通過測定聚合肌動蛋白可知血小板是否完全破裂。肌動蛋白是包括血小板在內(nèi)的許多細(xì)胞中組成性表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白，其以單體(g型)的形式存在于血小板內(nèi)，當(dāng)它被釋放時，會聚合(f型)并參與纖維蛋白凝塊的形成。因此，它可用于監(jiān)測血小板的活化/聚集。
很多臨床研究證實，血清和血漿中許多蛋白生物標(biāo)志物的含量是不同的。血清與血漿中的蛋白差異主要來自血小板α顆?；蜓h(huán)細(xì)胞的分泌蛋白。這些分泌蛋白包括CCL5、CCL7、CCL17、CXCL5、IL-8、LCN2、PDGF-BB、TGFβ1、VEGF、TNFα和TNFSF14等。以上蛋白在血清的含量比血漿中高，可能是因為其是由（在凝血過程中）血小板α顆?；蜓h(huán)細(xì)胞分泌的。其中，VEGF（vascular endothelial growth factor）稱為血管內(nèi)皮生長因子，是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促進血管通透性增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用。VEGF在腫瘤檢測中發(fā)揮著重要的作用，血清中的VEGF的水平受樣品中的血小板的量、樣品處理方式、時間、凝血過程、溫度等因素的影響，限制其在腫瘤檢測中的價值；而檢測血漿中的VEGF則能較為客觀地反應(yīng)腫瘤組織分泌VEGF的情況，故一般使用血漿作為基質(zhì)進行檢測 。對于凝血過程中血小板活化后釋放的或循環(huán)細(xì)胞分泌的蛋白標(biāo)志物檢測，建議選用含少量血小板或無血小板的血漿樣本。
表1: 血小板蛋白質(zhì)類別
3. 肝素與EDTA血漿：不同抗凝劑的影響
血漿抗凝劑的抗凝機制大致歸為兩種：(1)肝素作為抗凝劑，可有效抑制凝血酶活性; (2) EDTA和檸檬酸鹽螯合血液中游離的鈣和鎂離子，使凝血酶失去活性，中斷凝血。這兩種離子都是激活內(nèi)源性和外源性凝血反應(yīng)必需的。EDTA是一種不可逆的螯合劑，而檸檬酸的抗凝作用會因鈣的添加而逆轉(zhuǎn)，因此，可在檸檬酸鈉的血漿中進行可控的凝血研究。
2002年，WHO發(fā)表一份報告《USE OF ANTICOAGULANTS IN DIAGNOSTIC LABORATORY INVESTIGATIONS》， 對200多種的分析物（化學(xué)物質(zhì)、細(xì)胞、可溶性蛋白）進行了抗凝劑的推薦。
通過比較肝素和EDTA血漿，發(fā)現(xiàn)許多蛋白質(zhì)的含量在兩者體系中相近，但也存在某些蛋白質(zhì)（如CCL5, CXCL5和CXCL11）的含量差異較大。CCL5、CCL7、CXCL11和CXCL5均為與肝素能夠結(jié)合的蛋白，在肝素血漿中，這些蛋白在Ca2+的作用下與肝素結(jié)合，導(dǎo)致這四種蛋白質(zhì)含量在肝素和EDTA血漿中的含量是不同的。若在肝素血漿中去除肝素，這些蛋白質(zhì)會因肝素的缺失而使其構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響它們的檢測。
此外，中心粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase, NE）會因抗凝劑的不同在血漿中呈現(xiàn)不同的水平，NE在肝素血漿中的含量高于EDTA血漿。從目前的研究來看，抑制劑α-1蛋白酶抑制劑（α-1PI）可與中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶結(jié)合，形成一種抗變性復(fù)合物，使NE水解活性失活。肝素能顯著降低NE與α-1PI的結(jié)合，表明肝素的存在會使 α-1PI 中釋放更多的彈性蛋白酶，這可能是導(dǎo)致肝素血漿中中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶水平較高的原因。此外，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子家族成員在肝素血漿與EDTA血漿呈現(xiàn)的含量也不一致，研究表明，肝素結(jié)合嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子家族成員進而防止其在體內(nèi)裂解和失活 ， 而EDTA則不具有同樣的效果。這些例子表明抗凝劑可能影響某些蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，從而導(dǎo)致對蛋白質(zhì)的檢測結(jié)果發(fā)生改變。
生物標(biāo)志物在藥物開發(fā)和研究中發(fā)揮越來越重要的作用，本文對蛋白生物標(biāo)志物檢測的基質(zhì)選擇提出幾點建議：1.對于檢測免疫細(xì)胞中的或在凝血過程中血小板釋放的蛋白標(biāo)志物，建議選用含少量血小板或無血小板的血漿樣本，推薦使用CTAD或者ACD抗凝劑。因為這些抗凝劑對血小板激活的影響最??；2. 慎重選擇抗凝劑以減少因抗凝劑對蛋白標(biāo)志物的裂解作用，因為在凝血過程中會釋放或激活蛋白酶，而這些蛋白酶會降低蛋白標(biāo)志物的活性和可能改變其結(jié)構(gòu)；3.肝素會結(jié)合許多蛋白標(biāo)志物，并改變其結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性等，因此在考慮將肝素作為抗凝劑時，也應(yīng)評估潛在的影響。
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