ww.783成人A片,精国产品一区二区三区A片,羞羞视频在线免费观看,亚洲精品在线观看视频,强伦轩一区二区三区四区播放方式

中文
關(guān)于我們
主營業(yè)務(wù)
技術(shù)平臺
學(xué)術(shù)交流
新聞中心
加入我們
主營業(yè)務(wù)
表單填寫
*姓名
*電話
*郵箱
*公司
*留言信息
熙寧小課-第97期 | Bulk RNA-Seq聯(lián)合單細(xì)胞/空間轉(zhuǎn)錄組測序在疾病研究中的應(yīng)用
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時間:2023-03-03

在前期文章《RNA-Seq—特應(yīng)性皮炎分子機(jī)制研究的利器》中,對RNA-Seq在特異性皮炎分子機(jī)制研究中的作用進(jìn)行了詳細(xì)的闡述,可全面分析組織、血液、石蠟包埋切片(FFPE)等樣本的mRNA表達(dá)情況,探究特異性皮炎(AD)的發(fā)病機(jī)制,尤其是相關(guān)免疫和炎癥通路,如Th1、Th2、Th17、Th22細(xì)胞極化過程等。

熙寧生物|精翰生物持續(xù)關(guān)注行業(yè)最新研究方向與研究動態(tài),在傳統(tǒng)的Bulk RNA-seq的基礎(chǔ)上,我們結(jié)合單細(xì)胞/空間轉(zhuǎn)錄組的細(xì)胞類型注釋信息及各細(xì)胞亞群的特征基因集,基因差異表達(dá)分析、差異基因功能和通路注釋、可變剪切變異分析和新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測的分析的基礎(chǔ)上,通過自定義基因集,進(jìn)行基因集富集分析(GSEA)、基因集差異分析(GSVA)及細(xì)胞類型注釋分析,從炎癥及免疫的角度探究特異性皮炎患者用藥處理前后的特征基因表達(dá)譜變化,評估藥物的臨床效果。

 2.png

圖1 基因集富集分析


Bulk RNA-seq與單細(xì)胞/空間轉(zhuǎn)錄組

普通轉(zhuǎn)錄組測序(Bulk RNA-Seq)是提取組織、器官、群細(xì)胞的Total RNA進(jìn)行測序,得到的是一群細(xì)胞中單個基因的平均表達(dá)水平,用來比較不同個體或同一個體的不同組織間的表達(dá)差異,但對內(nèi)部細(xì)胞異質(zhì)性較強(qiáng)的系統(tǒng),如腫瘤組織,很多異常細(xì)胞的基因表達(dá)的信息會丟失,但是成本較低,技術(shù)成熟、通量高。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序是在單個細(xì)胞水平上構(gòu)建基因表達(dá)譜,能夠反映細(xì)胞的異質(zhì)性,但成本較高,測序深度較低,而且傳統(tǒng)的單細(xì)胞測序技術(shù)需要分離組織,可能因失去組織背景而導(dǎo)致解釋偏差。

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)對組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,能夠檢測疾病驅(qū)動下細(xì)胞在空間背景下的直接反應(yīng)信號,有助于了解組織微環(huán)境,然而其分辨率達(dá)不到單細(xì)胞水平。

雖然不同轉(zhuǎn)錄組學(xué)在樣本解析和數(shù)據(jù)分析層面存在差異,但是相互之間具有很強(qiáng)的互補(bǔ)性。

單細(xì)胞測序與Bulk RNA-seq一致性分析

對相同樣本組織進(jìn)行Bulk RNA-Seq與單細(xì)胞測序,可評估單細(xì)胞測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。Bernard T.l等采用此方法評估了單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)和 Bulk RNA-seq 數(shù)據(jù)的表達(dá)相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),解離誘導(dǎo)基因 Fos、Jun、Socs3、HSPA1A、HSPA1B 等在兩組測序結(jié)果中表達(dá)量接近,并且單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)和 Bulk Seq 測序數(shù)據(jù)整體相關(guān)性為 0.71,兩種基因表達(dá)譜具有較強(qiáng)的相關(guān)性。

 3.png

圖2 單細(xì)胞測序與Bulk RNA-seq一致性分析

單細(xì)胞/空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)提供Bulk RNA-seq的特征基因集

近期,S. Eyerich等使用10X Genomics的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在冷凍和H&E染色的皮膚切片中檢測基因表達(dá),從31名扁平苔蘚(LP)、特應(yīng)性皮炎(AD)及銀屑病患者樣本中獲得了62,000個皮膚轉(zhuǎn)錄組,通過與正常組織比較,發(fā)現(xiàn)IFNG、 IL13和IL17A分別在扁平苔蘚、AD和銀屑病的病變皮膚中高表達(dá)。研究者進(jìn)一步將細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄陽性斑點(diǎn)與表皮中所有剩余斑點(diǎn)進(jìn)行比較,由此確定974個IFNG相關(guān)、148個IL13相關(guān)和228個IL17A相關(guān)的上調(diào)差異表達(dá)基因集。

通過收集既往研究中單細(xì)胞測序定義疾病相關(guān)marker基因數(shù)據(jù)集,在Bulk-Seq中分析樣本中基因集的富集情況(GSVA、GSEA),比較用藥前后基因集變化,檢測疾病進(jìn)展,評估藥物臨床療效。

4.jpg

圖3 IL17A陽性的單細(xì)胞表達(dá)譜

單細(xì)胞測序與Bulk RNA-seq聯(lián)合分析

聯(lián)合分析可以對腫瘤組織的單細(xì)胞或空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞群鑒定及亞群細(xì)分,探究不同細(xì)胞群間基因的表達(dá)異質(zhì)性,獲取與腫瘤相關(guān)的細(xì)胞群、通路、轉(zhuǎn)錄因子及特征基因集。對不同部位樣本進(jìn)行Bulk RNA-seq,可以分析重點(diǎn)基因marker 的表達(dá)量變化趨勢,評估其對免疫及代謝通路的影響。

 5.png

圖4 不同亞群差異基因富集分析

Alexander S. 等對5位三陰乳腺癌患者的腫瘤組織進(jìn)行單細(xì)胞測序,根據(jù)測序結(jié)果將癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CTL)分為4個亞群,肌成纖維樣CAF(MyCAFs)、炎癥性CAF(iCAF)、分化PVL(dPVL)和不成熟PVL(imPVL),并獲取每個亞群的特征基因集。為進(jìn)一步探究不同基質(zhì)亞群對免疫逃逸的影響,研究者計算了三陰乳腺癌患者Bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集中myCAF、iCAF、dPVL和imPVL簇的特征基因集的平均表達(dá)與T淋巴細(xì)胞浸潤(CTL)水平的相關(guān)性。結(jié)果表明,iCAF功能障礙特征基因集表達(dá)水平較低的患者中,CTL水平較高,可顯著提高患者的存活率,而在iCAF功能障礙特征基因集表達(dá)水平高的患者中,CTL水平與預(yù)后沒有相關(guān)性,這表明炎癥性CAF(iCAF)在TNBC中驅(qū)動功能障礙的CTL中發(fā)揮了作用。

利用單細(xì)胞數(shù)據(jù)注釋進(jìn)行Bulk RNA-seq的細(xì)胞組成分析

與腫瘤組織微環(huán)境類似,皮炎患者的病變組織內(nèi)部及周圍往往聚集著大量的免疫細(xì)胞。這些免疫細(xì)胞之間,存在著千絲萬縷,免疫細(xì)胞多種多樣,即所謂免疫微環(huán)境或免疫浸潤的分析,本質(zhì)上,就是弄清楚腫瘤組織中免疫細(xì)胞的構(gòu)成比例。

CIBERSORT技術(shù)基于線性支持向量回歸的原理對免疫細(xì)胞亞型表達(dá)矩陣進(jìn)行去卷積,利用單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù),提取特征后,反推Bulk-seq各類細(xì)胞成分所占比例。

 6.png

圖5 細(xì)胞類型注釋

PHA(植物血凝素)能促進(jìn)有絲分裂和誘導(dǎo)干擾素分泌,是常用的T淋巴細(xì)胞活化誘導(dǎo)劑。對PHA刺激前后的PBMC進(jìn)行Bulk RNA-seq測序,根據(jù)基因表達(dá)量進(jìn)行細(xì)胞類型注釋,可以看到(圖5),PHA刺激后的樣本中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的比例顯著增加,Treg 通過主動調(diào)節(jié)的方式,抑制存在于正常機(jī)體內(nèi)潛在的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化與增殖,發(fā)揮免疫抑制和免疫穩(wěn)態(tài)方面的特性。當(dāng)T細(xì)胞活化增殖,刺激Treg細(xì)胞活化,擴(kuò)增的Tregs能有效抑制基因應(yīng)答,并誘導(dǎo)產(chǎn)生新的Treg細(xì)胞,以持續(xù)的方式放大了循環(huán)水平。

熙寧生物|精翰生物提供RNA-Seq測序服務(wù),可整合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組/空間轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞類型注釋數(shù)據(jù),補(bǔ)充并完善特異性細(xì)胞類型及不同代謝通路的特征基因集,通過基因集富集分析、基因集差異分析及細(xì)胞類型注釋分析,從多個角度評估藥物對代謝通路及臨床表型的影響,助力申辦方開展藥物作用機(jī)制研究和生物標(biāo)志物研究。


參考文獻(xiàn):

[1]Subramanian A, Tamayo P, Mootha V K, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2005, 102(43): 15545-15550.

[2]H?nzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data[J]. BMC bioinformatics, 2013, 14: 1-15.

[3]Sch?bitz A, Hillig C, Mubarak M, et al. Spatial transcriptomics landscape of lesions from non-communicable inflammatory skin diseases[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 7729.

[4]Wu S Z, Roden D L, Wang C, et al. Stromal cell diversity associated with immune evasion in human triple‐negative breast cancer[J]. The EMBO journal, 2020, 39(19): e104063.

[5]Newman A M, Liu C L, Green M R, et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles[J]. Nature methods, 2015, 12(5): 453-457.


專屬客服
免費(fèi)通話
表單填寫
回到頂部