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熙寧小課-第85期 | T細(xì)胞激活檢測指標(biāo)以及臨床應(yīng)用案例
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時間:2022-10-21

T細(xì)胞的激活檢測指標(biāo)

T淋巴細(xì)胞(T lymphocyte)簡稱T細(xì)胞,來源于骨髓的淋巴干細(xì)胞,在胸腺中分化、發(fā)育成熟后,通過淋巴和血液循環(huán)分布到全身免疫器官和組織中發(fā)揮免疫功能。它具有多種生物學(xué)功能,如直接殺傷靶細(xì)胞,輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,對特異性抗原和促有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)以及產(chǎn)生細(xì)胞因子等,是身體中為抵御疾病感染、腫瘤發(fā)生而形成的英勇斗士。

T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫, T 淋巴細(xì)胞活化是免疫應(yīng)答的核心?;罨腡細(xì)胞表面表達(dá)CD69、CD25、CD38、CD71和HLA-DR等分子,Ki67的表達(dá)與CD71正相關(guān)。激活后早期(30-60 min)檢測到CD69基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),但在4-6 h后迅速下降;CD69蛋白表達(dá)早在刺激2-3 h后就能檢測到。因此CD69被廣泛用作早期活化的標(biāo)記物。體外T細(xì)胞的活化可以用anti-CD3和anti-CD28的抗體或磁珠,PHA,PMA等刺激。

使用PHA體外刺激PBMC,然后將PBMC置于37℃,含有7%的CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),檢測不同時間點CD3陽性細(xì)胞群中CD25,CD69,CD71和HLA-DR的表達(dá),結(jié)果如圖1, CD69是最早檢測到的分子,在15 h達(dá)到峰值,之后隨著時間延長,表達(dá)量降低;CD25和CD71在刺激15 h才可以被檢測到,并分別于刺激后144 h和96 h達(dá)到峰值,HLA-DR在刺激后的峰值表達(dá)量最低,HLA-DR,CD25和CD71在刺激后可在較長一段時間維持較高的表達(dá)。激活抗原表達(dá)量如表1。

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除上文所述的T細(xì)胞激活指標(biāo),CD38和Ki67也是T細(xì)胞的活化抗原,且Ki67的表達(dá)與CD71的表達(dá)呈正相關(guān)。用Anti-CD3/CD28抗體體外刺激PBMC,CD4+和CD8+細(xì)胞上的CD25,CD69,CD38,CD71和Ki67刺激后各時間點的表達(dá)量如圖2和圖3。刺激早期就可以檢測到CD69的表達(dá),在刺激4 h內(nèi)可以檢測到CD25,CD71,CD38的表達(dá),但是Ki67在刺激4 h未見明顯增加;刺激后6 h,CD8+細(xì)胞群的CD25,CD69和CD38表達(dá)量顯著上調(diào),在CD4+細(xì)胞群中這些活化抗原表達(dá)量未見明顯變化,Ki67在CD4+和CD8+細(xì)胞群中表達(dá)量都顯著上調(diào);刺激后24 h,CD4+和CD8+細(xì)胞群中的CD25和CD69表達(dá)都大于90%,CD71和Ki67在CD8+細(xì)胞群的表達(dá)明顯高于其在CD4+中的表達(dá);刺激后48 h,CD25,CD69, CD71和Ki67在CD4+和CD8+細(xì)胞群的表達(dá)量均達(dá)到90%以上且一直持續(xù)到72 h(除CD69),CD69的表達(dá)在刺激后72 h則呈下降趨勢;CD38在CD8+細(xì)胞群的表達(dá)于刺激后48 h達(dá)到90%以上,而在CD4+細(xì)胞群則在刺激后72 h達(dá)到90%以上。

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圖2


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圖3

臨床應(yīng)用案例

在喉癌患者中,腫瘤組織中的早期活化抗原CD69和CD71表達(dá)高于健康人的上皮組織,晚期活化抗原CD25與健康人的表達(dá)量無明顯差異,另一晚期活化抗原HLA-DR在腫瘤組織的表達(dá)量高于健康人,用PHA分別刺激腫瘤組織細(xì)胞和健康人上皮細(xì)胞后的結(jié)果與不刺激的結(jié)果類似,如下 表2。


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外周血中CD4+和CD8+細(xì)胞群的活化抗原表達(dá)與腫瘤組織表達(dá)差異較大,在喉癌患者的外周血中,CD69,CD71和HLA-DR在CD8+細(xì)胞群中的表達(dá)略高于健康人,在CD4+細(xì)胞群中的表達(dá)則無明顯差異,CD25的 表達(dá)在CD4+和CD8+細(xì)胞群中均與健康人無差異,如下表3.

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對于T細(xì)胞激活以及免疫系統(tǒng)激活類型的藥物,如IL2類藥物及多特異性抗體、IL15類藥物及多特異性抗體、CD3類的多特異性抗體,靶向OX40、CD40、4-1BB等的激動劑類抗體,以及藥物作用中會減少Treg亞群,進(jìn)而可能造成免疫系統(tǒng)的激活的藥物類型,進(jìn)行T細(xì)胞激活檢測指標(biāo)的檢測,都是一項重要的藥效或者安全性指標(biāo)。部分信息可以參考之前的公眾號文章《單抗激動劑藥物應(yīng)該如何做臨床PD檢測——以O(shè)X40單抗為例》。

熙寧生物在支持藥物的臨床分析中,已經(jīng)積累的大量經(jīng)驗,已經(jīng)完成和正在進(jìn)行的臨床研究有十余個。已經(jīng)積累了豐富的經(jīng)驗,主要包括:

1.基于流式細(xì)胞術(shù)的T細(xì)胞激活指標(biāo)分析,包括4-1BB,CD69,HLA-DR,CD25等亞群占比分析;

2.基于流式細(xì)胞術(shù)的淋巴細(xì)胞亞群分析,具體包括T, B, NK, Mono等亞群的占比和絕對數(shù)量分析; Treg 亞群分析;T cell EM,CM等亞群分析;

3.基于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞增殖分析,包括Ki67+占比分析和EdU+細(xì)胞陽性率分析;

4.基于流式細(xì)胞術(shù)的受體占位率分析;

5.基于流式細(xì)胞術(shù)的受體表達(dá)量分析;

6.基于MSD,ELISA,Luminex和CBA的細(xì)胞因子分析;

7.基于ELISPOT的T細(xì)胞,B細(xì)胞激活分析。


參考文獻(xiàn)

1.Cibrián, Danay, and Francisco Sánchez‐Madrid. "CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper." European journal of immunology 47.6 (2017): 946-953.

2.Motamedi, Melika, Lai Xu, and Shokrollah Elahi. "Correlation of transferrin receptor (CD71) with Ki67 expression on stimulated human and mouse T cells: The kinetics of expression of T cell activation markers." Journal of immunological methods 437 (2016): 43-52.

3.Caruso, Arnoldo, et al. "Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation." Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology 27.1 (1997): 71-76.

4.Starska, Katarzyna, et al. "Prognostic value of the immunological phenomena and relationship with clinicopathological characteristics of the tumor—the expression of the early CD69+, CD71+ and the late CD25+, CD26+, HLA/DR+ activation markers on T CD4+ and CD8+ lymphocytes in squamous cell laryngeal carcinoma. Part II." Folia Histochemica et Cytobiologica 49.4 (2011): 593-603.

5.Starska, Katarzyna, et al. "The role of tumor cells in the modification of T lymphocytes activity—the expression of the early CD69+, CD71+ and the late CD25+, CD26+, HLA/DR+ activation markers on T CD4+ and CD8+ cells in squamous cell laryngeal carcinoma. Part I." Folia Histochemica et Cytobiologica 49.4 (2011): 579-592.


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