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一、背景介紹
DNA和組蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)親和性和功能來(lái)進(jìn)行修飾，這些修飾的改變是腫瘤的標(biāo)志之一。表觀遺傳治療致力于促進(jìn)或維持惡性表型的DNA甲基化模式或組蛋白翻譯后修飾正?；?。近年來(lái)，組蛋白的乙酰化修飾是表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的熱門研究方向。研究者發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；桥c機(jī)體生理功能及病理表征聯(lián)系最為緊密的修飾化之一。HDACs和HATs 等去乙?；蛞阴；赴悬c(diǎn)是表觀遺傳抗腫瘤領(lǐng)域研究的熱門靶點(diǎn)，在相關(guān)藥物的臨床試驗(yàn)中，組蛋白乙?；降淖兓撬幬锆熜У囊粋€(gè)重要指標(biāo)。
圖1. 組蛋白乙?；叭ヒ阴；感揎椣嚓P(guān)酶分子簡(jiǎn)介
二、流式檢測(cè)組蛋白乙酰化的基本原理
一般認(rèn)為，組蛋白乙?；揎椂鄶?shù)發(fā)生在組蛋白H3或H4N端特定的賴氨酸殘基上，目前市面上已有很多抗乙?；M蛋白H3和H4直接標(biāo)記的流式抗體。臨床相關(guān)的組蛋白乙?；疢arker有很多，如H3K9ac、H3K14ac和H4K5ac等，使用對(duì)應(yīng)Marker的抗體進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)流式檢測(cè)某熒光素對(duì)應(yīng)通道的信號(hào)值或信號(hào)比值（如H3K9ac/H3），來(lái)反映細(xì)胞組蛋白乙?；膹?qiáng)弱。
三、關(guān)于模擬臨床樣品的設(shè)計(jì)考量
1.生物基質(zhì)的選擇
考慮到臨床分析，該檢測(cè)需采用全血或分離的PBMC進(jìn)行。
圖2. 全血樣本白細(xì)胞中H3K9乙酰化水平
2.不同水平組蛋白乙酰化模擬臨床樣品的制備
在全血或PBMC體外加藥處理調(diào)節(jié)組蛋白乙?；磉_(dá)水平，生成高表達(dá)或低表達(dá)的模擬臨床樣品，處理不同時(shí)長(zhǎng)后，獲取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。
圖3. 西達(dá)本胺（HDACI）處理不同時(shí)長(zhǎng)，
PBMC組蛋白乙?；降淖兓?/p>
圖4. 不同藥物（包含HDACI和HATI）
處理后H3K9ac水平的變化
四、關(guān)于方案設(shè)計(jì)要點(diǎn)的考量
1.儲(chǔ)存條件對(duì)組蛋白乙酰化水平的影響
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，全血樣品可在臨床中心采集后盡量24h(建議不超過(guò)48h)內(nèi)于4°C運(yùn)輸至檢測(cè)中心，盡快裂紅或裂紅固定，裂紅后的細(xì)胞盡快-80°C保存，裂紅固定后的細(xì)胞保存不超過(guò)一周，進(jìn)行流式檢測(cè)分析，文獻(xiàn)結(jié)果如圖5。
該檢測(cè)可考慮熙寧生物自主產(chǎn)權(quán)的凍存全血的方法，無(wú)需裂紅，可直接凍存。
圖5. 患者給藥LBH589(HDACI)后，采集全血，裂紅固
定，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體內(nèi)白細(xì)胞組蛋白乙?；降淖兓?/p>
2.固定、破膜或破膜固定劑的選擇對(duì)染色效果的影響
由于不同的固定、破膜或破膜固定劑的成分可能會(huì)影響抗體的結(jié)合以及導(dǎo)致熒光素分子降解，從而影響信號(hào)強(qiáng)度，甚至檢測(cè)不到陽(yáng)性信號(hào)，因此需要選擇合適的固定、破膜或破膜固定劑。
圖6. 固定破膜試劑基本信息匯總
五、熙寧優(yōu)勢(shì)
蛋白的磷酸化、甲基化、乙?；?、ADP-核糖化修飾和泛素化等共價(jià)修飾的變化是細(xì)胞生理狀態(tài)，機(jī)體健康狀態(tài)，藥物是否發(fā)揮藥效的重要指標(biāo)。在藥物臨床研究階段，檢測(cè)蛋白翻譯后修飾水平，評(píng)估給藥前后的變化情況，成為臨床階段一些小分子藥物的主要藥效學(xué)（PD）指標(biāo)之一，可用于指導(dǎo)創(chuàng)新藥物二期臨床試驗(yàn)的用藥劑量。
熙寧生物流式細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)，具有10余年藥物開(kāi)發(fā)和生物標(biāo)志物檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，并成功開(kāi)發(fā)了超100種不同的生物標(biāo)志物方法，用于臨床階段藥物安全性和有效性的評(píng)估，其中包括一系列基于流式平臺(tái)、ELISA和MSD平臺(tái)的磷酸化蛋白、甲基化蛋白、ADP-核糖化修飾、泛素化和乙?；鞍椎臋z測(cè)方法，助力藥物臨床研究。歡迎各位新老朋友，前來(lái)探討您感興趣的靶點(diǎn)和檢測(cè)方法。
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