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呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是全球范圍內(nèi)引起嬰幼兒、免疫缺陷人群及老年人急性下呼吸道疾?。ˋcute Lower Respiratory Tract Infections，ALRTIs）的主要病原體之一，具有高度傳染性和致病性，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者支氣管炎、肺炎和哮喘的發(fā)生，給家庭造成了嚴(yán)重的疾病和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
RSV分為A和B兩種亞型，不同亞型又包括多種基因型，在流行季節(jié)，不同基因型可同時(shí)傳播，其高傳染性及致死率亟需有效的預(yù)防和治療手段。目前，多條路線制備的RSV疫苗正處于臨床發(fā)展的不同階段，其中2家已獲批上市，分別為GSK的Arexvy和輝瑞的Abrysvo，均為Pre-F重組蛋白疫苗，以及Moderna MRESVIA，為mRNA疫苗。Moderna mRNA-1345也處于上市申請(qǐng)階段，為mRNA疫苗。此外，預(yù)防性的單克隆抗體Palivizumab和Nirsevimab分別獲批上市，用于預(yù)防新生兒和嬰兒由RSV引起的下呼吸道感染。
疫苗開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵是能夠衡量其有效性，隨著越來(lái)越多的RSV疫苗和預(yù)防性藥物獲批上市和進(jìn)入臨床階段，RSV產(chǎn)品的臨床評(píng)價(jià)方法變得越來(lái)越重要，這主要包括中和抗體、結(jié)合抗體、病毒載量以及細(xì)胞免疫等方面的內(nèi)容。
PART 01
RSV中和抗體檢測(cè)
RSV疫苗和預(yù)防性藥物旨在誘導(dǎo)強(qiáng)大的RSV病毒中和免疫反應(yīng)，Palivizumab和Nirsevimab證明RSV中和抗體可針對(duì) RSV引起的嚴(yán)重下呼吸道疾病提供被動(dòng)保護(hù)，驗(yàn)證了RSV中和抗體與預(yù)防保護(hù)的相關(guān)性。WHO也支持使用RSV中和抗體檢測(cè)作為評(píng)估RSV疫苗免疫原性的初步方法，即作為RSV預(yù)防保護(hù)性的主要血清學(xué)標(biāo)志。然而，目前全球有多種不同的RSV中和抗體檢測(cè)方法，開(kāi)發(fā)出一種準(zhǔn)確、高通量的RSV中和抗體檢測(cè)方法，對(duì)于RSV產(chǎn)品臨床標(biāo)準(zhǔn)化以及評(píng)估新型RSV疫苗候選物都具有重要意義，不僅有助于提高RSV產(chǎn)品研發(fā)的效率，而且對(duì)于全球范圍內(nèi)的RSV疫苗和預(yù)防藥物的臨床效果評(píng)估和對(duì)比也至關(guān)重要。
傳統(tǒng)的中和抗體檢測(cè)方法為噬斑減少中和試驗(yàn)（Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT）和微量細(xì)胞中和試驗(yàn)，此外，基于ELISA、ELISpot等技術(shù)的中和抗體檢測(cè)方法，可通過(guò)針對(duì)病毒蛋白的抗體對(duì)感染細(xì)胞中病毒蛋白進(jìn)行檢測(cè)，具有簡(jiǎn)單、快速、高通量和高度敏感性等優(yōu)勢(shì)，且在多種RSV疫苗和預(yù)防性藥物的中和抗體檢測(cè)中均有適用。如圖1所示，不同RSV中和抗體檢測(cè)在檢測(cè)方法、病毒、細(xì)胞、顯色模式、檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)、通量等方面有所不同。圖2為不同RSV疫苗和預(yù)防性藥物臨床試驗(yàn)使用的中和抗體檢測(cè)方法。
圖1 RSV中和抗體檢測(cè)方法
圖2 RSV疫苗和預(yù)防性藥物臨床試驗(yàn)中和抗體檢測(cè)方法
噬斑減少中和試驗(yàn)（PRNT）
PRNT指的是適當(dāng)稀釋的血清與病毒中和后，感染細(xì)胞對(duì)形成的空斑進(jìn)行定量測(cè)定的方法。盡管該方法在多種病毒中能反映出中和抗體對(duì)病毒感染宿主細(xì)胞的病理影響，但具有周期長(zhǎng)，操作條件要求高，成本高及通量低等不足之處。
微量細(xì)胞中和試驗(yàn)（CPE）
微量細(xì)胞中和試驗(yàn)指的是連續(xù)稀釋的病毒與血清中和后，感染細(xì)胞，根據(jù)是否存在細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic Effect，CPE)進(jìn)行定量測(cè)定的方法。但該方法檢測(cè)周期較長(zhǎng)，且不同的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)于細(xì)胞病變的判定標(biāo)準(zhǔn)不同，這在很大程度上會(huì)造成不可避免的人為誤差。
微孔病毒中和試驗(yàn)，檢測(cè)病毒蛋白含量
基于ELISA或ELISpot的中和抗體檢測(cè)方法，可通過(guò)針對(duì)病毒蛋白的抗體對(duì)感染細(xì)胞中病毒蛋白進(jìn)行檢測(cè)，具有高度敏感性和可重復(fù)性，且在多種病毒中和抗體檢測(cè)中均可適用，如RSV、流感病毒、SARS-CoV-2等。
如圖3所示，RSV中和抗體和RSV病毒預(yù)先孵育，然后加入HEp-2細(xì)胞再進(jìn)行一定時(shí)間的孵育，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)RSV抗原含量來(lái)反映中和抗體的中和病毒效果。
圖3 RSV微孔病毒中和后檢測(cè)病毒蛋白含量
病毒報(bào)告基因中和試驗(yàn)
該方法為基于RSV-GFP/Luciferase重組病毒的微量細(xì)胞中和試驗(yàn)法，將一定濃度的樣本、RSV中和抗體與含報(bào)告基因（GFP/Luciferase）的RSV病毒預(yù)先孵育，然后加入HEp-2細(xì)胞再進(jìn)行一定時(shí)間的孵育，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的熒光信號(hào)或者luciferase的表達(dá)來(lái)反映中和抗體的中和病毒效果。
圖4 RSV病毒報(bào)告基因中和試驗(yàn)
PART 02
小結(jié)
熙寧生物|精翰生物以分析科學(xué)為核心能力，為新藥臨床與臨床前研究提供專業(yè)技術(shù)服務(wù)。在疫苗臨床研究領(lǐng)域，我們擁有完善的檢測(cè)平臺(tái)和一站式檢測(cè)服務(wù)能力，開(kāi)發(fā)了基于ELISA、Fluorescence、Luminescence高通量的中和抗體評(píng)估方法，具有基于ELISpot、ICS的細(xì)胞免疫檢測(cè)能力，支持中美、中澳、多中心、大樣本量的臨床試驗(yàn)，有著豐富的海外樣品進(jìn)口經(jīng)驗(yàn)。
熙寧生物|精翰生物在RSV臨床研究領(lǐng)域的項(xiàng)目檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)非常豐富，可提供一體化、高效率的臨床生物分析服務(wù)，包括：
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微孔病毒中和法進(jìn)行血清中RSV-A和RSV-B中和抗體滴度檢測(cè)；
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ELISA/MSD方法進(jìn)行血清中RSV 抗F蛋白的特異性抗體濃度檢測(cè)；
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RT-qPCR方法進(jìn)行RSV病毒載量檢測(cè)；
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ELISPOT和ICS方法進(jìn)行RSV抗原多肽特異性T細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)；
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參考文獻(xiàn)：
[1] 疫苗臨床試驗(yàn)抗體分析方法研究技術(shù)指導(dǎo)原則
[2] Development of a High-Throughput Respiratory Syncytial Virus Fluorescent Focus-Based Microneutralization Assay
[3] RSV neutralization assays – Use in immune response assessment
[4] Expansion of the 1st WHO international standard for antiserum to respiratory syncytial virus to include neutralisation titres against RSV subtype B An international collaborative study
[5] An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay
