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熙寧小課-第149期 | 免疫組庫(kù)測(cè)序打開(kāi)藥物研發(fā)新視野（六）：TCR免疫組庫(kù)測(cè)序在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用（下
上文熙寧小課-第146期 | 免疫組庫(kù)測(cè)序打開(kāi)藥物研發(fā)新視野（五）：TCR免疫組庫(kù)測(cè)序在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用（上）以TRB為例，從克隆多樣性、CDR3長(zhǎng)度分布、V-J基因使用頻率分布等方面對(duì)單個(gè)樣本的TCR免疫組庫(kù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了簡(jiǎn)單展示。
本文將對(duì)受檢者*經(jīng)治療后的不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的樣本進(jìn)行 T 細(xì)胞受體基因克隆鑒定檢測(cè)，對(duì)每個(gè)樣本 TCR 的克隆比例、克隆多樣性、V/J 基因的使用頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，識(shí)別樣本間的共有克隆，并追蹤不同樣本 TCR 指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，如克隆總數(shù)、克隆類(lèi)型、多樣性指數(shù)、克隆豐度等，以TRB為例進(jìn)行展示（注：圖示中所有數(shù)據(jù)均來(lái)自虛擬樣本）。
PART 01
免疫監(jiān)測(cè)為腫瘤免疫治療提供臨床指導(dǎo)
在腫瘤免疫治療中，通過(guò) TCR 免疫組庫(kù)測(cè)序追蹤同一個(gè)患者在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的T細(xì)胞克隆類(lèi)型與比例變化，可以提供非常重要的臨床信息和指導(dǎo)意義：
·
治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)：觀察到特定的TCR克隆在治療前后或治療期間的相對(duì)穩(wěn)定或顯著擴(kuò)增，可能指示這些克隆對(duì)應(yīng)T細(xì)胞具有有效的抗腫瘤活性，這對(duì)于評(píng)估免疫治療效果至關(guān)重要。若治療后這些效應(yīng)T細(xì)胞克隆比例上升，則提示治療起效，反之則可能提示治療失敗或耐藥；
·
免疫監(jiān)測(cè)與復(fù)發(fā)預(yù)警：如果治療后原本消失或減少的腫瘤相關(guān)TCR克隆再次升高，可能預(yù)示著腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)TCR譜的變化，可以提前發(fā)現(xiàn)病情變化，指導(dǎo)臨床決策；
·
治療反應(yīng)預(yù)測(cè)：識(shí)別出患者體內(nèi)預(yù)先存在的抗腫瘤TCR克隆，可以預(yù)測(cè)患者對(duì)某些免疫療法（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑、T細(xì)胞受體工程改造療法等）的響應(yīng)可能性；
·
免疫逃逸機(jī)制研究：分析腫瘤微環(huán)境中TCR克隆的動(dòng)態(tài)變化，有助于揭示腫瘤如何通過(guò)免疫編輯過(guò)程實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，從而改進(jìn)現(xiàn)有治療策略，開(kāi)發(fā)新的治療手段。
PART 02
時(shí)序樣本TCR免疫組庫(kù)測(cè)序結(jié)果
注：下圖中的樣本信息和結(jié)果均來(lái)自模擬數(shù)據(jù)
2.1 樣本間共有克隆分析
統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本的共有克隆的數(shù)目，結(jié)果見(jiàn)圖1，根據(jù)多個(gè)樣本的CDR3序列及頻率繪制聚類(lèi)熱圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖1 多個(gè)樣本克隆類(lèi)型一致性venn圖
上圖為多個(gè)樣本中克隆類(lèi)型一致性分布的韋恩圖。該圖支持2~5個(gè)樣本的可視化，圖中的數(shù)字表示重疊樣本的共有克隆的數(shù)目。
圖2 多個(gè)樣本共有克隆表達(dá)量聚類(lèi)熱圖
上圖為不同樣本的克隆頻率聚類(lèi)熱圖，其中，每一列為一個(gè)樣本，每一行為一種克隆。按克隆類(lèi)型進(jìn)行聚類(lèi)，反應(yīng)樣本間的克隆分布的相似性。藍(lán)色表示該克隆在對(duì)應(yīng)樣本中克隆頻率較高，黃色表示該克隆在對(duì)應(yīng)樣本中克隆頻率較低。
不同樣本中可能存在相同的克隆，依據(jù)克隆在樣本中共同存在的情況，有助于分析組間、組內(nèi)的差異和共性，有助于分析尋找疾病特異性克隆。
如果一個(gè)或幾個(gè)特定的T細(xì)胞克隆在治療前后的不同樣本中持續(xù)存在且比例增加，這可能表明這些克隆具有針對(duì)腫瘤的有效免疫反應(yīng)。特別是在免疫治療后，同一克隆的增多可能代表這些T細(xì)胞成功地識(shí)別并消滅了腫瘤細(xì)胞，提示治療有效。
若在治療后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，仍然能在患者體內(nèi)檢測(cè)到相同的效應(yīng)T細(xì)胞克隆，尤其是那些腫瘤特異性T細(xì)胞克隆，這可能意味著患者已經(jīng)建立了持久的免疫記憶，有利于防止腫瘤復(fù)發(fā)。
相反，若治療后，原本預(yù)期應(yīng)被激活的特定克隆并未顯著擴(kuò)增或反而減少，這可能暗示腫瘤出現(xiàn)了免疫逃逸機(jī)制或者患者對(duì)當(dāng)前治療不敏感，提示治療可能無(wú)效或產(chǎn)生了耐藥性。
2.2 樣本間 V/J 基因使用頻率分析
統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本中 V，J 基因的使用頻率，結(jié)果見(jiàn)圖3 與圖4。
圖3 不同樣本V基因頻率分布柱狀圖
上圖為不同樣本的 V 基因頻率分布柱狀圖，其中，X軸表示不同的 V 基因，Y軸表示克隆頻率，不同的樣本由不同顏色表示。
圖4 不同樣本J基因頻率分布柱狀圖
上圖為不同樣本的 J 基因頻率分布柱狀圖，其中，X軸表示不同的 J 基因，Y軸表示克隆頻率，不同的樣本由不同顏色表示。
當(dāng)免疫治療有效時(shí)，通常伴隨著腫瘤特異性T細(xì)胞的激活和擴(kuò)增。這些T細(xì)胞可能具有特定的TCR結(jié)構(gòu)，其V和J基因的使用頻率會(huì)在治療后顯著增加。因此，如果發(fā)現(xiàn)某些V/J基因組合的頻率在治療后有所升高，可能說(shuō)明這些T細(xì)胞正積極地參與對(duì)抗腫瘤，從而提示治療效果良好。
另一方面，如果預(yù)期應(yīng)該對(duì)治療產(chǎn)生反應(yīng)的特定V/J基因使用頻率未見(jiàn)明顯上升，甚至減少，可能提示腫瘤正在通過(guò)免疫逃逸機(jī)制躲避T細(xì)胞攻擊，或者治療未能有效激活相應(yīng)的抗腫瘤T細(xì)胞克隆，從而提示治療效果不佳或產(chǎn)生耐藥性。
2.3 多時(shí)間節(jié)點(diǎn)動(dòng)態(tài)分析
由于樣本存在時(shí)序關(guān)系，為展示不同時(shí)間點(diǎn)樣本間 TCR 重組序列的變化情況，對(duì)多個(gè)樣本的克隆數(shù)、克隆類(lèi)型、多樣性指數(shù)、克隆分率分布等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)圖5-7，篩選了每個(gè)樣本表達(dá)量最高的前20條克隆組成新的克隆群，追蹤該克隆群體在不同樣本間克隆頻率的變化，見(jiàn)圖8。
圖5 不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)樣本高頻克隆的TCR指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化折線圖
上圖為不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)樣本的 TCR 克隆數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。X軸為不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的樣本，柱形圖展示了不同樣本的 TRB 的克隆類(lèi)型與克隆總數(shù)，Y軸為L(zhǎng)og10（克隆數(shù)）。
圖6 多樣性指數(shù)變化折線圖
上圖為不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)樣本的 TCR 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。X軸為不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的樣本，折線圖展示了不同樣本的 TRB 的克隆克隆多樣性指數(shù)。
圖7 不同樣本的克隆豐度組成累計(jì)頻率分布圖
上圖為多個(gè)樣本的克隆豐度的密度分布圖。其中 X 軸 Log10(克隆頻率)， Y 軸表示處于該區(qū)間的克隆頻率的百分比。反應(yīng)不同樣本的克隆豐度組成變化情況。
圖8 不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)樣本高頻克隆的頻率變化追蹤圖
上圖為時(shí)序樣本特定克隆的堆疊面積圖，其中，X軸表示不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)（不同樣本），陰影面積的大小反應(yīng)克隆頻率的大小。不同樣本間的共有克隆由相同的顏色表示。
在腫瘤免疫治療中，不同樣本中T細(xì)胞克隆的豐度和多樣性指數(shù)的變化能夠從一定程度反映腫瘤治療的臨床效果。
有效的免疫治療可能導(dǎo)致T細(xì)胞庫(kù)的多樣性增加，這是因?yàn)橛懈嗟哪[瘤特異性T細(xì)胞被激活和擴(kuò)增，增加了整體T細(xì)胞克隆的多樣性，這是免疫系統(tǒng)響應(yīng)的一種積極信號(hào)；在某些情況下，治療后T細(xì)胞多樣性降低可能是因?yàn)樯贁?shù)高效應(yīng)T細(xì)胞克隆占據(jù)了優(yōu)勢(shì)，這在一定程度上可能反映出了治療的成功，但如果整體多樣性降低過(guò)于顯著，也可能提示免疫系統(tǒng)整體功能受限或偏向單一反應(yīng)，不利于長(zhǎng)期控制腫瘤；對(duì)于免疫衰老或腫瘤導(dǎo)致的T細(xì)胞多樣性喪失，治療后多樣性趨于穩(wěn)定或恢復(fù)，可能表明治療有助于重建健康的免疫平衡，有利于治療效果的持久性。
通過(guò)全面分析克隆豐度和多樣性指數(shù)的變化，可以幫助臨床醫(yī)生評(píng)估治療策略的有效性、預(yù)后以及耐藥性，同時(shí)也為個(gè)體化治療方案的制定提供了科學(xué)依據(jù)。
2.4 TILs 來(lái)源的克隆殘留比例追蹤
在腫瘤微環(huán)境中，TILs的克隆組成反映了機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)強(qiáng)度和特異性。在 TILs（Tumor-Infiltrating Lymphocytes） 介導(dǎo)的腫瘤免疫治療過(guò)程中對(duì)TILs在血液和腫瘤組織中的殘留量、活性和克隆分布的連續(xù)監(jiān)測(cè)有助于了解治療效果和調(diào)整后續(xù)治療策略。
圖9 樣本TILs來(lái)源的TRB克隆殘留比例折線圖
上圖為樣本TILs 來(lái)源的 TRB 克隆殘留比例折線圖，其中，X軸表示不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)（不同樣本），縱坐標(biāo)表示克隆殘留比例（%）。
TILs 注射后在患者體內(nèi)的殘留比例變化取決于多種復(fù)雜因素，包括體內(nèi)歸巢與增殖、免疫抑制微環(huán)境、免疫抑制劑的聯(lián)合使用、TILs的質(zhì)量和純度、患者個(gè)體差異等，這些因素相互作用影響TILs在體內(nèi)的持久性、增殖能力、抗腫瘤活性以及最終的治療效果。
2.5 樣本相似性計(jì)算及聚類(lèi)
當(dāng)樣本數(shù)>3時(shí)，統(tǒng)計(jì)樣本間的克隆序列分布相似性指數(shù)：Morisita’s overlap index。根據(jù)相似性對(duì)樣本進(jìn)行聚類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖10。Morisita 重疊指數(shù)的計(jì)算公式為：
xi 是克隆 i 在一個(gè)克隆總數(shù)為 X 的樣本中出現(xiàn)的次數(shù)。
yi 是克隆 i 在一個(gè)克隆總數(shù)為 Y 的樣本中出現(xiàn)的次數(shù)。
S 是克隆類(lèi)型總數(shù)。
圖10 多樣本相似性聚類(lèi)樹(shù)狀圖
上圖展示了多個(gè)樣本的樹(shù)狀結(jié)構(gòu)，分支長(zhǎng)度顯示了樣本克隆序列之間的距離。
不同治療組間的聚類(lèi)可以區(qū)分出對(duì)治療響應(yīng)良好和不良的患者群體，通過(guò)比較治療前后的TCR譜系變化，可以判斷治療是否有效激活了腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)；不同類(lèi)型的腫瘤或疾病階段具有獨(dú)特的TCR譜系特征，聚類(lèi)分析可以幫助細(xì)化疾病分型，甚至預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展或轉(zhuǎn)歸；分析腫瘤樣本和正常對(duì)照之間的TCR克隆差異，可以識(shí)別出可能與腫瘤免疫逃逸相關(guān)的TCR克隆，從而深入了解腫瘤如何規(guī)避免疫監(jiān)視。多組樣本TCR免疫組庫(kù)測(cè)序的樣本聚類(lèi)分析有助于深入了解免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)病和治療過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，為臨床提供更精準(zhǔn)的診斷、預(yù)后判斷以及個(gè)體化治療方案設(shè)計(jì)。
PART 03
小結(jié)
免疫組庫(kù)檢測(cè)方法揭示了免疫系統(tǒng)多樣性和克隆擴(kuò)增狀態(tài)，除了用于腫瘤的免疫治療外，還可用于研究病原體感染過(guò)程中宿主免疫反應(yīng)的多樣性、識(shí)別關(guān)鍵抗體序列；探究自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制及其潛在治療靶點(diǎn)；研究移植后宿主對(duì)移植物的免疫反應(yīng)，為優(yōu)化移植后免疫抑制方案提供依據(jù)。由此可知，免疫組庫(kù)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥研發(fā)的重要工具，不僅促進(jìn)了免疫療法的進(jìn)步，也在多種治療領(lǐng)域發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
熙寧|精翰NGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用基于多重PCR建庫(kù)的免疫組庫(kù)檢測(cè)方法特異性地?cái)U(kuò)增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測(cè)T/B細(xì)胞受體基因的克隆性重排，在時(shí)序樣本檢測(cè)中，通過(guò)檢測(cè)患者體內(nèi)TCR譜系的變化來(lái)評(píng)估治療效果以及跟蹤疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)。本檢測(cè)方法已經(jīng)經(jīng)過(guò)了完善的性能驗(yàn)證，可以供申辦方直接使用。
熙寧|精翰NGS實(shí)驗(yàn)室依據(jù)CAP質(zhì)量的要求，建立了完善的質(zhì)量體系。實(shí)驗(yàn)室擁有NextSeq CN500測(cè)序儀，支持本地測(cè)序，且多次滿分通過(guò)CAP的能力驗(yàn)證。按照質(zhì)量體系的要求，實(shí)驗(yàn)室建立了豐富的檢測(cè)方法，全面支撐藥物的安全性評(píng)估、治療效果評(píng)估、入組篩查和生物標(biāo)志物的探索等，在藥物研發(fā)的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用：
?
以慢病毒為載體的CAR-T細(xì)胞治療中，識(shí)別有致瘤性的或者其他潛在危險(xiǎn)的整合位點(diǎn)，評(píng)估整合事件的多樣性和偏好性，輔助評(píng)估藥物潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)；
?
通過(guò)對(duì)腫瘤微小殘留病灶（MRD）的檢測(cè)，評(píng)估藥物治療效果并提示預(yù)后，提前提示復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)并指導(dǎo)后續(xù)干預(yù)；
?
通過(guò)基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，幫助申辦方識(shí)別與疾病關(guān)聯(lián)的基因突變、融合突變和拷貝數(shù)變異等，識(shí)別受試者藥物靶點(diǎn)變異情況，以及與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和相關(guān)信號(hào)通路的基因變化，從而指導(dǎo)患者入排，發(fā)現(xiàn)藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，并指導(dǎo)耐藥機(jī)制研究和新的治療策略開(kāi)發(fā)；
?
評(píng)估候選藥物對(duì)基因表達(dá)的影響，篩選出對(duì)特定靶標(biāo)有顯著作用的化合物，同時(shí)通過(guò)分析藥物處理前后基因表達(dá)變化，優(yōu)化藥物的劑量、作用機(jī)制和潛在副作用。
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