前言
抗體藥物偶聯(lián)物(antibody-drug conjugate,ADC)是一類重要的靶向治療藥物。ADCs是通過一個化學(xué)鏈接將具有生物活性的小分子藥物連接到單抗上,單抗作為載體將小分子藥物靶向運輸?shù)侥繕思毎?。如圖1 所示ADC藥物分子包含抗體、linker、小分子藥物三個結(jié)構(gòu)模塊。
圖1
毒性小分子藥物通過linker與抗體偶聯(lián),Linker是ADC的重要組成部分。Linker有不同類型,例如腙(hydrazone)linker、二硫化物(disulfide)linker和斷裂或非斷裂的肽linker。這些linker釋放活性毒性小分子藥物的方式在體內(nèi)有明顯的不同。如圖2所示,由于Linker的不同也導(dǎo)致ADC藥物進入體內(nèi)經(jīng)過酶或者化學(xué)反應(yīng)得到的代謝產(chǎn)物不同。
圖2
生物分析在ADC藥物開發(fā)中對于安全性和有效性的評價起著至關(guān)重要的作用。ADC獨特而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征需要特殊的生物分析策略,這與應(yīng)用于小分子外源性生物制劑和大分子生物制劑(如肽或治療性蛋白制品)的分析策略不同。如圖3所示,ADC生物分析的內(nèi)容主要包括未偶聯(lián)的毒性小分子藥物,偶聯(lián)的毒性小分子藥物,ADC(即偶聯(lián)的單克隆抗體),總毒性小分子藥物,裸抗和總單克隆抗體。由于ADCs的復(fù)雜性,樣品制備可能具有挑戰(zhàn)性,因此應(yīng)在ADC各個部分的生物分析工作流程中仔細考慮和執(zhí)行樣品制備。由于在之前公眾號文章中已經(jīng)分享了基于LC-MS檢測抗體的相關(guān)方法,本章則主要描述不同的樣品制備技術(shù)及其在未偶聯(lián)的毒性小分子藥物,偶聯(lián)的毒性小分子藥物定量分析中的應(yīng)用。
圖3
非偶聯(lián)毒性小分子藥物
未偶聯(lián)的毒性小分子藥物包括給藥后血漿或腫瘤組織中與活性藥物解離的毒性小分子藥物,以及活性藥物制劑中殘留的毒性小分子藥物。
用于非偶聯(lián)毒性小分子藥物生物分析的樣品提取方法如圖4所示,其中包括蛋白質(zhì)沉淀(PPT)、固相萃?。⊿PE)、液-液萃?。↙LE)。由于基質(zhì)中存在各種蛋白酶,采集后樣品基質(zhì)中未偶聯(lián)的毒性小分子藥物水平可能會由于樣品穩(wěn)定性問題導(dǎo)致游離小分子毒物濃度增加。因此,需要在樣品采集完或提取前添加蛋白酶抑制劑混合物或在冰水浴中進行樣品提取,以防止或最大限度地減少樣品制備過程中來自ADC的毒性小分子藥物解偶聯(lián)。同時也需要考慮毒性小分子藥物在基質(zhì)中的穩(wěn)定性。例如,DM1含有一個游離硫醇部分,可能會與血清中的其他含硫醇分子發(fā)生二聚或反應(yīng),樣品可以使用還原劑TCEP進行處理,或者可以采用冰浴前處理,前處理試劑也需要提前預(yù)冷。由于ADCs屬于靶向制劑,理想狀態(tài)下在正常的組織或者部位不會釋放出小分子毒物,因此給藥后在健康受試者或動物模型中小分子毒物的濃度很低,對于我們在檢測游離藥物濃度的定量下限濃度要求就會設(shè)置很低,有可能會到pg級。一般的前處理方式可能無法滿足我們的檢測需求,通常在優(yōu)化完液相質(zhì)譜條件后,需要優(yōu)化前處理方式,比如由蛋白沉淀改為液液萃取或者固相萃取等。
圖4
偶聯(lián)毒性小分子藥物
偶聯(lián)毒性小分子藥物即為毒性小分子藥物通過linker與抗體偶聯(lián)。偶聯(lián)毒性小分子藥物需要根據(jù)linker的性質(zhì)和類型(裂解型和非裂解型)決定前處理方式,從而釋放出游離的毒性小分子藥物進行檢測。一般可以通過免疫親和捕獲或者根據(jù)ADCs與未偶聯(lián)毒性小分子藥物的親水/疏水性質(zhì)不同進行物理分離,從而使偶聯(lián)毒性小分子藥物與未偶聯(lián)毒性小分子藥物分開。然后依linker不同的性質(zhì)或類型使用對應(yīng)的處理方式將偶聯(lián)毒物釋放,最后通過LC-MS進行檢測。
a)偶聯(lián)毒性小分子藥物(裂解型linker)
通常裂解型linker(腙,二硫鍵,肽鏈等)在細胞微環(huán)境中經(jīng)過化學(xué)或者溶酶體蛋白酶的作用下釋放出毒性小分子藥物。例如,腙linker對pH敏感,在較低pH下,通過在包涵體和/或溶酶體等隔間中斷裂釋放活性毒性小分子藥物;二硫鍵利用細胞內(nèi)的還原環(huán)境釋放毒性小分子藥物;裂解型的肽linker被溶酶體蛋白酶酶切。在檢測偶聯(lián)毒性小分子藥物時,首先需要從生物基質(zhì)中將偶聯(lián)毒性小分子藥物和未偶聯(lián)毒性小分子藥物進行分離。常用的主要有免疫親和捕獲如圖5所示,可以使用Biotin標記特異性單克隆抗體,使用鏈霉親和磁珠進行提取,亦可采用Protein A或Protein G磁珠進行免疫親和捕獲。偶聯(lián)毒性小分子藥物分離結(jié)束后,根據(jù)Linker類型選擇合適的裂解方式,例如加入還原劑DTT,或者使用組織蛋白酶進行裂解釋放出毒性小分子藥物,然后對樣品進行進一步純化處理,最后使用LC-MS進樣分析。另外也可以使用物理方法,例如液液萃取或者固相萃取如圖6所示,將疏水性游離的毒性小分子藥物提取出來,再向樣品中加入組織蛋白酶裂解釋放毒性小分子藥物用于LC-MS檢測。
圖5(Acta Pharmaceutica Sinica, 2016)
圖6
b)偶聯(lián)毒性小分子藥物(非裂解型linker)
非裂解型Linker偶聯(lián)的毒性小分子藥物檢測相對較為復(fù)雜,可能無法通過酶裂解釋放出毒性小分子藥物,一般會形成與肽偶聯(lián)毒性小分子藥物的樣品混合物,通過檢測替代肽偶聯(lián)毒性小分子藥物來反映偶聯(lián)毒性小分子藥物的濃度。因此當linker是酶非裂解型,在樣品前處理過程中存在諸多挑戰(zhàn)。首先,標準品不容易獲得,因為標準品是毒性小分子藥物與從抗體酶解的肽偶聯(lián),并且標準品通常需要毒性小分子藥物與肽的額外偶聯(lián),這將根據(jù)偶聯(lián)位點和蛋白酶在抗體中的切割位置而變化,此外混合毒性小分子藥物試驗還需要包括相應(yīng)的內(nèi)標(IS)。第二,毒性小分子藥物和/或linker可以在不與循環(huán)中的抗體解偶聯(lián)的情況下進行代謝,這將導(dǎo)致不同的分析物需要通過LC-MS/MS進行檢測。理論上非裂解型Linker偶聯(lián)的毒性小分子藥物檢測也可以通過親和免疫捕獲,其方法與裂解型Linker偶聯(lián)的毒性小分子藥物的方法相同,提取結(jié)束后加入還原劑TCEP/DTT破壞二硫鍵,加入碘乙酰胺保護二硫鍵,最后使用胰蛋白酶進行酶解后進樣分析。
總結(jié)
由于ADC兼具了單克隆抗體藥物高度特異性和靶向性的特點,以及小分子藥物清除癌細胞的高效性,能協(xié)同發(fā)揮抗體藥物和化學(xué)藥物各自的優(yōu)點,能夠降低對生物系統(tǒng)的傷害。因此ADC藥物研發(fā)異?;馃?,對于偶聯(lián)技術(shù)、新型細胞毒素、藥物負載提升等進行了創(chuàng)新,于此同時這也對生物分析也提出了新的挑戰(zhàn)。但是親和捕獲LC-MS方法由于其自身的特點(開發(fā)周期段,特異性強,同時檢測多個待測物)在進行ADC藥物安全性和有效性的評價時,因此在檢測偶聯(lián)的毒性小分子藥物,偶聯(lián)的毒性小分子藥物,ADC(即偶聯(lián)的單克隆抗體),裸抗和總單克隆抗體應(yīng)用也會越來越廣。