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1.簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)甲基化
蛋白質(zhì)甲基化一般指精氨酸或賴氨酸在蛋白質(zhì)序列中的甲基化，是翻譯后修飾的一種形式。精氨酸可以被甲基化一次（稱為一甲基精氨酸）或兩次（精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMTs）將兩個(gè)甲基同時(shí)轉(zhuǎn)移到精氨酸多肽末端的同一個(gè)氮原子上成為非對(duì)稱性甲基精氨酸，或者在每個(gè)氮端各加一個(gè)甲基成為對(duì)稱性二甲基精氨酸），賴氨酸經(jīng)賴氨酸轉(zhuǎn)移酶的催化可以甲基化一次、兩次或三次。組蛋白甲基化是指發(fā)生在H3和H4組蛋白N端Arg或Lys殘基上的甲基化，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)催化。某些組蛋白殘基通過甲基化可以抑制或激活基因表達(dá)，從而形成為表觀遺傳。
H3K27me3
組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（Trimethylated Histone H3 at Lysine 27）是最常見的組蛋白甲基化修飾之一，由多梳抑制復(fù)合物2（Polycombrepressive Complex 2，PRC2）產(chǎn)生，而PRC2組成部分的改變，如Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2（Enhancer of Zeste Homolog2，EZH2）功能改變或過表達(dá)會(huì)使H3K27me3表達(dá)失衡，細(xì)胞增殖分化失控，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。EZH2是多梳蛋白家族（Polycomb Groups，PcG）的核心催化亞基，通過組蛋白甲基的一個(gè)高度保守區(qū)域SET催化組蛋白H3K27發(fā)生甲基化，從而使抑癌基因表達(dá)下調(diào)。
H3K27me3的檢測(cè)方法
目前H3K27me3檢測(cè)方法主要有Western Blot、免疫組織化學(xué)（IHC）、染色質(zhì)免疫沉淀-測(cè)序（ChIP-Seq）、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）等，其中FCM具有分析能力強(qiáng)和多參數(shù)的特點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)到H3K27me3水平在多個(gè)細(xì)胞群中表達(dá)量的差異。目前，F(xiàn)CM多與Western Blot聯(lián)合用于EZH2抑制劑的藥效學(xué)研究，評(píng)估該類型藥物對(duì)多個(gè)細(xì)胞群組蛋白甲基化水平的影響。隨著細(xì)胞通路研究的深入，F(xiàn)CM有望在單細(xì)胞水平直接檢測(cè)胞內(nèi)H3K27me3的表達(dá)水平。
流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry）
是一種對(duì)細(xì)胞群體中的單個(gè)細(xì)胞或類似細(xì)胞大小的顆粒進(jìn)行快速、連續(xù)檢測(cè)的技術(shù)。其基本原理是：細(xì)胞或其他微粒與相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)蛋白或抗體結(jié)合，基于層流規(guī)律的流體動(dòng)力學(xué)聚焦樣本形成單細(xì)胞流，將單細(xì)胞隊(duì)列快速傳輸至激光光源與液流正交的位置時(shí)，在特定波長(zhǎng)的發(fā)射光源激發(fā)下，形成多角度散射光，和細(xì)胞攜帶的各種熒光染料被激發(fā)發(fā)出特征熒光，這些光譜能夠被機(jī)器的信號(hào)接收器接收，通過光電轉(zhuǎn)換器，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。儀器收集、和測(cè)量眾多單細(xì)胞的散射光和熒光信號(hào)并進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用廣泛，包括細(xì)胞亞群比例及濃度測(cè)定、細(xì)胞功能分型（活化、耗竭、分化時(shí)態(tài)、免疫檢查點(diǎn)等）、細(xì)胞功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞增殖、凋亡、周期、鈣流、殺傷、吞噬功能等）、胞內(nèi)染色（胞內(nèi)因子、核內(nèi)因子、胞內(nèi)活化激酶等）、分泌細(xì)胞因子檢測(cè)（流式液相多重蛋白定量CBA技術(shù)）、微生物學(xué)檢測(cè)（細(xì)菌、真菌、病毒等鑒定，微生物活性等）、表觀遺傳學(xué)相關(guān)檢測(cè)等。
基本檢測(cè)原理
使用熒光素偶聯(lián)的抗H3K27me3抗體和抗Total H3抗體，通過流式分析H3K27me3/Total H3的MdFI比值，反應(yīng)細(xì)胞甲基化的強(qiáng)弱。且通過標(biāo)記不同細(xì)胞亞群，評(píng)估給藥后的甲基化變化情況，結(jié)果更具有代表意義。
圖1：流式設(shè)門圖舉例
圖2：人外周血中甲基化基線水平示意圖
2. H3K27me3檢測(cè)用于臨床早期藥效評(píng)估
在臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究過程中，人外周血作為最容易獲取的生物基質(zhì)，是用于進(jìn)行臨床早期用于評(píng)價(jià)藥理藥效的作為重要的生物基質(zhì)。根據(jù)已上市EZH2抑制劑藥物Tazemetostat披露的研究資料，采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)進(jìn)行用藥后人外周血中特定細(xì)胞亞型的H3K27me3水平，如圖3所示，Tazemetostat用藥后，在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中，H3K27me3水平有明顯的下降，而在T細(xì)胞中，H3K27me3水平?jīng)]有明顯變化。
圖3：Tazemetostat對(duì)PBMC中不同亞型細(xì)H3K27me3水平的影響
3. 常用的標(biāo)本類型和處理方法
人外周血：抗凝采血管進(jìn)行采集，樣品經(jīng)裂紅、固定、破膜等處理后，可于-70℃中長(zhǎng)期保存、批量分析。對(duì)樣品運(yùn)輸時(shí)效要求相對(duì)較高，臨床中心具備相關(guān)處理能力時(shí)，可節(jié)省運(yùn)輸成本，但需保證各臨床中心操作的一致性。
4. 實(shí)驗(yàn)流程
本文闡述釋通用型方法驗(yàn)證的相關(guān)實(shí)驗(yàn)流程，即使用抗凝全血進(jìn)行H3K27me3相關(guān)檢測(cè)流程。
01采集適量新鮮的抗凝全血。
02取出適當(dāng)體積的新鮮全血，加入適當(dāng)體積的細(xì)胞裂紅固定液進(jìn)行裂紅、固定，洗滌，破膜。
03破膜后的樣品可用于檢測(cè)或轉(zhuǎn)入凍存管中于-70℃冰箱長(zhǎng)期保存。
04封閉液封閉，表面/胞內(nèi)/核內(nèi)抗體孵育。
05上機(jī)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品檢測(cè)。
5. 精翰生物部分測(cè)試數(shù)據(jù)展示
1.室溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
以上僅為某個(gè)方法開發(fā)數(shù)據(jù)舉例，在不同細(xì)胞亞群中穩(wěn)定性結(jié)果有差別，至48小時(shí)，T/B/NK/粒細(xì)胞/單核穩(wěn)定（%CV＜35%），其中，粒細(xì)胞、單核細(xì)胞指標(biāo)，至72小時(shí)穩(wěn)定。
圖4：粒細(xì)胞中測(cè)試結(jié)果示意圖（MdFI信號(hào)比值）
圖5：?jiǎn)魏思?xì)胞中測(cè)試結(jié)果示意圖（MdFI信號(hào)比值）
2.破膜后-70℃凍存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
以上僅為某個(gè)方法開發(fā)數(shù)據(jù)舉例，采集全血樣品，經(jīng)裂紅固定、Perm處理后，-70℃凍存保存2個(gè)月MdFI比值在T/B/NK/粒細(xì)胞亞群中均較穩(wěn)定。
圖6：-70℃凍存儲(chǔ)存2個(gè)月穩(wěn)定性數(shù)據(jù)示意圖，更長(zhǎng)時(shí)間的凍存穩(wěn)定性待測(cè)試
6.應(yīng)用
H3K27me3是SCLC化療耐藥性的潛在治療靶點(diǎn)：在一項(xiàng)小細(xì)胞肺癌（SCLC）化療機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，H3K27me3可通過調(diào)節(jié)HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOTAIR）促使HOXAI DNA 甲基化進(jìn)而誘導(dǎo)SCLC的多藥耐藥性。
H3K27me3是腫瘤治療的重要預(yù)后指標(biāo)：在一項(xiàng)鼻咽喉癌（NPC）放化療后的研究中發(fā)現(xiàn)，H3K27me3的高表達(dá)與NPC患者的生存期縮短密切相關(guān)，提示H3K27me3可作為預(yù)測(cè)NPC放化療反應(yīng)和患者預(yù)后的免疫標(biāo)志物。然而，在結(jié)腸癌化療中發(fā)現(xiàn)，H3K27me3的低水平預(yù)示著治療效果差。對(duì)于不同腫瘤而言，H3K27me3在治療中顯示出的表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)所代表的的意義并不一致，需要結(jié)合具體作用機(jī)制綜合分析。同樣，使用H3K27me3進(jìn)行預(yù)后分析時(shí)，也有相似情況。例如H3K27me3的表達(dá)缺失與乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。與之相反，有研究者發(fā)現(xiàn)H3K27me3在肝細(xì)胞癌的高表達(dá)與血管浸潤(rùn)密切相關(guān)，并預(yù)示患者的預(yù)后差。
此外，H3K27me3作為生物標(biāo)志物在相關(guān)表現(xiàn)遺傳新藥的開發(fā)和評(píng)價(jià)中也具有重要意義。例如通過細(xì)胞的高通量篩選法，以H3K27me3為靶點(diǎn)從329049個(gè)化合物中鑒定出EZH2介導(dǎo)基因沉默的新藥NPD13668。在EZH2選擇性抑制劑EPZ005687對(duì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育的研究中，發(fā)現(xiàn)該藥物可抑制H3K27me3并增強(qiáng)神經(jīng)元的分化等。在EZH2抑制劑的臨床藥物研究中，進(jìn)行H3K27me3水平的檢測(cè)，是在臨床早期進(jìn)行EZH2抑制劑藥理藥效研究最為重要的手段，同時(shí)該檢測(cè)結(jié)果還可為II期臨床實(shí)驗(yàn)最優(yōu)藥物劑量的選擇提供重要依據(jù)。EZH2抑制劑可基于H3K27me3水平的藥效學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)合最大耐受藥物劑量數(shù)據(jù)，選擇合適的藥物劑量以達(dá)到最佳藥效，并降低毒副作用，助力更加精準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。
參考文獻(xiàn)：
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4. CDYL promotes the chemoresistance of small cell lung cancer by regulation H3K27 trimethylation at the CDKNIC promoter[J]. QIU ZG, ZHU WL, MENG H, et al. Theranostics, 2019, 9(16):4717-4729.
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6. Poster, Chromatin Flow Cytometry Based Assessment of H3K27me3 Pharmacodynamics in Blood from Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) and Follicular Lymphoma (FL) Patients Following Exposure to the EZH2 Inhibitor Tazemetostat Reveals Disparate Response Profiles in Specific PBMC Subpopulations.
