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熙寧小課-第83期 | 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）在細(xì)胞治療、基因治療和疫苗研發(fā)中的應(yīng)用
前言
酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（Enzyme Linked Immunospot Assay，簡(jiǎn)稱ELISPOT）是細(xì)胞免疫學(xué)研究中最為敏感的檢測(cè)方法，可以在單細(xì)胞水平對(duì)抗體分泌細(xì)胞(如B細(xì)胞)及細(xì)胞因子分泌細(xì)胞（如T細(xì)胞）進(jìn)行檢測(cè)，該方法有極高的靈敏度，可達(dá)20-25斑點(diǎn)/100萬細(xì)胞，并且該方法能夠?qū)乖碳ず蟮幕罴?xì)胞進(jìn)行功能性檢測(cè)，是疫苗領(lǐng)域藥效評(píng)估的關(guān)鍵檢測(cè)方法。隨著生物藥領(lǐng)域向腫瘤免疫深入邁進(jìn)，ELISPOT技術(shù)也逐步成為基因治療，細(xì)胞治療（CART, TCRT），抗體/雙特異抗體藥物的生物分析領(lǐng)域的主流技術(shù)。
酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的基本流程
酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的基本原理是通過免疫細(xì)胞和對(duì)應(yīng)的刺激物進(jìn)行共培養(yǎng)，然后使用類似于ELISA雙抗夾心法對(duì)有刺激反應(yīng)的免疫細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。由于免疫細(xì)胞激活機(jī)理的復(fù)雜性性，根據(jù)免疫細(xì)胞的來源選擇，刺激物的類型，刺激方式的不同會(huì)衍生出不同應(yīng)用方向，不同靈敏度的ELISPOT檢測(cè)方法，其簡(jiǎn)要的流程如圖1所示
圖1：ELISPOT技術(shù)基本操作流程
ELISPOT技術(shù)用于疫苗藥效學(xué)評(píng)估
目前ELISPOT技術(shù)最為廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是用于感染性疫苗的臨床階段的藥效學(xué)評(píng)估，通常采用感染性病毒受體片段多肽庫(kù)（如新冠S蛋白多肽庫(kù)）作為刺激物，通常取臨床受試者的免疫細(xì)胞進(jìn)行共孵育培養(yǎng)，通常為T細(xì)胞，有時(shí)會(huì)將T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，示例如下圖2康希諾生物Ad5載體重組蛋白新冠疫苗和輝瑞/BioNTech mRNA新冠疫苗使用ELISPOT技術(shù)用于疫苗的細(xì)胞免疫藥效學(xué)評(píng)估。
圖2：ELISPOT技術(shù)用于感染性疫苗的藥效學(xué)評(píng)估
ELISPOT技術(shù)也是腫瘤疫苗進(jìn)行臨床階段的藥效學(xué)評(píng)估的重要檢測(cè)和篩選技術(shù)。相對(duì)于感染性疫苗，腫瘤疫苗引起人體的免疫反應(yīng)較弱，同時(shí)由于腫瘤的異質(zhì)性，腫瘤疫苗需要表達(dá)多樣化的腫瘤相關(guān)抗原或者新生抗原來使患者獲得對(duì)于腫瘤的免疫能力。ELISPOT技術(shù)基于其高靈敏性是腫瘤疫苗進(jìn)行早期藥效學(xué)評(píng)估，判斷疫苗中各個(gè)相關(guān)抗原或者新生抗原是否對(duì)人體有效，支持后續(xù)的臨床決策非常關(guān)鍵的檢測(cè)技術(shù)，如圖3某DC腫瘤疫苗在單一腫瘤相關(guān)抗原多肽刺激下的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。
圖3：ELISPOT技術(shù)用于腫瘤疫苗腫瘤相關(guān)抗原的評(píng)估
在CDE發(fā)布的《新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究》指導(dǎo)原則中如圖4同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了mRNA疫苗的質(zhì)量研究需要進(jìn)行體內(nèi)效力試驗(yàn)，推薦使用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)評(píng)價(jià)mRNA疫苗的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
圖4：mRNA疫苗藥學(xué)生物活性研究?jī)?nèi)容
ELISPOT技術(shù)用于CART的免疫原性評(píng)估
CART細(xì)胞免疫療法是將來自人體的T細(xì)胞經(jīng)過基因編輯，安裝上能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞的特異性蛋白受體，然后擴(kuò)增后回輸回人體。由于基因編輯后的CART細(xì)胞能夠持續(xù)在人體擴(kuò)增，并且特異性的識(shí)別腫瘤細(xì)胞，起到殺傷病人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的作用，CART在人體的持續(xù)擴(kuò)增和存續(xù)是CART細(xì)胞免疫療法取得杰出療效的關(guān)鍵，而人體針對(duì)CART細(xì)胞的免疫原性是影響CART細(xì)胞擴(kuò)增存續(xù)的關(guān)鍵因素。目前上市靶向CD19的幾款CART產(chǎn)品其特異性蛋白受體均是鼠源的FCM63 scFV，有較強(qiáng)的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于文獻(xiàn)披露的FCM63 scFV是否存在免疫原性，每個(gè)上市CART產(chǎn)品測(cè)定的ADA發(fā)生率差異較大，但整體的結(jié)論是ADA不影響藥效。
目前上市的CART其適應(yīng)癥均在血液腫瘤領(lǐng)域，在實(shí)體瘤領(lǐng)域鮮有突破，對(duì)此Wagner，2021在Immunogenicity of CAR T cells in cancer therapy的綜上中提到了一個(gè)可能的原因，由于現(xiàn)有的CART產(chǎn)品主要是靶向清除B細(xì)胞，同時(shí)在治療前均進(jìn)行了清除淋巴細(xì)胞的處理，
CART產(chǎn)品注射后由于人體免疫細(xì)胞的缺失不會(huì)產(chǎn)生對(duì)CART細(xì)胞的免疫原性，短時(shí)間不會(huì)影響到CART的療效。隨著人體免疫系統(tǒng)的恢復(fù)，即使人體潛在存在針對(duì)CART的免疫原性，由于CART細(xì)胞會(huì)持續(xù)殺傷B細(xì)胞，中短期不會(huì)影響到CART的療效，但是針對(duì)CART的免疫原性T細(xì)胞會(huì)最終影響到CART的存續(xù)，影響到CART產(chǎn)品的長(zhǎng)期藥效。同時(shí)文獻(xiàn)記載針對(duì)B細(xì)胞血液瘤的CART產(chǎn)品再次回輸不會(huì)取得很好的療效也是潛在CART免疫原性會(huì)影響到藥效的佐證。而在實(shí)體瘤領(lǐng)域，CART產(chǎn)品注射后人體如果產(chǎn)生了免疫原性，人體的B細(xì)胞會(huì)分泌針對(duì)CART的中和抗體，阻斷CART細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，人體的T細(xì)胞會(huì)攻擊CART細(xì)胞，影響到CART細(xì)胞的大量擴(kuò)增和存續(xù)，進(jìn)而影響到CART產(chǎn)品針對(duì)實(shí)體瘤的療效?？偨Y(jié)來說，免疫原性是影響到CART療效，特別是實(shí)體瘤療效，以及是否能再次回輸?shù)年P(guān)鍵因素之一，如圖5。
圖5：免疫原性對(duì)血液腫瘤和實(shí)體瘤CART療效的影響
Brudno在2020年發(fā)表過對(duì)比試驗(yàn)，使用ELISSOT技術(shù)檢測(cè)CART產(chǎn)品的免疫原性，評(píng)估攜帶FCM63的CART和全人anti-CD19的CART產(chǎn)品對(duì)于CART產(chǎn)品的存續(xù)的影響，如下圖，總結(jié)來說全人抗CD19 CART人血液中CART一個(gè)月后，有細(xì)胞免疫原性的個(gè)體和無細(xì)胞免疫原性的個(gè)體分組，體液循環(huán)中CART的數(shù)量沒有顯著差異。FCM63 CART人血液中CART一個(gè)月后，有細(xì)胞免疫原性的個(gè)體和無細(xì)胞免疫原性的個(gè)體分組，體液循環(huán)中CART的數(shù)量雖然差異不夠顯著，但是有變小的趨勢(shì)，如圖6。
圖6：FCM63和人源CD19抗體CART免疫原性和CART細(xì)胞存續(xù)的相關(guān)性
同種異體CART（通用型CART） 是CART藥物降低成本，提高患者可及性，滿足未被充分滿足臨床需求的關(guān)鍵，改造后的同種異體CART是否具有能夠達(dá)到預(yù)期的效果，使用健康個(gè)體的PBMC作為免疫細(xì)胞，輻照后的同種異體CART 作為刺激物，使用高靈敏度的ELISPOT技術(shù)進(jìn)行評(píng)估是相對(duì)較優(yōu)的評(píng)估模式，見圖7。
圖7:ELISPOT技術(shù)用于通用型CART的免疫排異評(píng)估
ELISPOT試驗(yàn)用于AAV基因治療藥物的細(xì)胞免疫原性評(píng)估
2019年FDA批準(zhǔn)諾華公司研發(fā)的Zolgensma?（Onasemnogene abeparvovec，AVXS-101）在美國(guó)上市，用于治療2歲以下脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）的兒童患者。2022年8月STAT和Endpoints News先后報(bào)道，兩名兒童在接受Zolgensma治療后死亡，原因查明，罪魁禍?zhǔn)资羌毙愿喂δ芩ソ?。急性肝功能發(fā)生的根本原因是Zolgensma的病毒載體為AAV9對(duì)肝臟均具有較強(qiáng)的親嗜性，如下圖8所示該AAV9基因藥物注射到人體后會(huì)感染人的肝細(xì)胞，其衣殼蛋白會(huì)被肝細(xì)胞水解，形成HLAI病毒多肽復(fù)合物。人體的CD8+毒性T細(xì)胞會(huì)識(shí)別HLAI病毒多肽復(fù)合物，從而攻擊人體的肝細(xì)胞，引起級(jí)聯(lián)的炎癥反應(yīng)，造成患者發(fā)生急性肝功能衰竭。通過ELISPOT的技術(shù)評(píng)估病毒載體在人體是否能引起T細(xì)胞免疫反應(yīng)是臨床評(píng)估基因治療安全性重要的指標(biāo)參數(shù)。
圖8：AAV基因治療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞免疫原性引起的肝臟毒性機(jī)理
基于AAV基因治療一次治療，長(zhǎng)期有效的特征，AAV基因治療產(chǎn)品的細(xì)胞免疫原性將是影響其安全性，同時(shí)也是影響其有效性最為核心的考察項(xiàng)，如圖9所示，在一款凝血因子的AAV2基因治療藥物，其療效受限于機(jī)體逐步增強(qiáng)的針對(duì)于病毒載體的細(xì)胞免疫原性。
圖9：使用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)因治療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞免疫原性
熙寧酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）技術(shù)經(jīng)驗(yàn)
酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）作為最為靈敏的檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)也是最容易受到干擾的檢測(cè)技術(shù)，其方法的穩(wěn)定性，樣品穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)解讀是關(guān)鍵。
ELISPOT的檢測(cè)結(jié)果除了受樣品的功能活性的影響，同時(shí)受到樣品的活性的影響和個(gè)體免疫學(xué)遺傳背景的影響，在驗(yàn)證和檢測(cè)過程中需要設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照組，基于分組需要有完善的方法學(xué)驗(yàn)證方案和驗(yàn)證參數(shù)用于數(shù)據(jù)的解讀.如圖10
圖10. ELISPOT試驗(yàn)分組設(shè)置以及驗(yàn)證參數(shù)
PBMC的活性將極大的受到全血采集后的保存時(shí)間的影響，通常情況下全血采集后8小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PBMC分離，PBMC的活性才能有效的保留，極大了限制了ELISPOT的應(yīng)用。熙寧生物自主開發(fā)的全血穩(wěn)定劑配方和全血保存/分離條件的摸索積累，可將全血保存時(shí)間延長(zhǎng)至30小時(shí)再分離PBMC，ELISPOT結(jié)果無顯著的變化，同時(shí)在48小時(shí)進(jìn)行分離PBMC，ELISPOT結(jié)果能夠大部分保留，如圖11。
圖11.熙寧生物基于全血穩(wěn)定劑分離PBMC的全血穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果
相比文獻(xiàn)記載，不經(jīng)過全血穩(wěn)定劑處理的全血在放置24小時(shí)和48小時(shí)后，得到的斑點(diǎn)數(shù)目有80%以上的丟失如圖12，極大了延長(zhǎng)了全血運(yùn)輸穩(wěn)定性，增加了ELISPOT樣品分析的可及性。
圖12.未經(jīng)全血穩(wěn)定劑分離PBMC的全血穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果
熙寧生物提供臨床前和臨床階段細(xì)胞治療、基因治療和疫苗類藥物研發(fā)的細(xì)胞免疫原性檢測(cè)服務(wù)，歡迎咨詢。
參考資料：
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