配體結(jié)合分析實驗(Ligand Binding Assay,以下簡稱LBA)廣泛應(yīng)用于大分子生物藥物領(lǐng)域,在藥代動力學(xué)分析、免疫原性和生物標(biāo)志物分析中占據(jù)重要的地位,貫穿了生物藥臨床前到臨床上市監(jiān)測的整個過程。關(guān)鍵試劑是整個LBA方法的基石,在實際的檢測分析中,往往會遇到批次更換的情況。本文將主要從關(guān)鍵試劑批次變化對方法性能產(chǎn)生的影響及對產(chǎn)生的影響如何進行評估進行闡述。
關(guān)鍵試劑(critical reagent),從字面意思理解,是指分析過程中對方法的性能及參數(shù)表現(xiàn)至關(guān)重要的試劑。監(jiān)管機構(gòu)和一些文獻也提出將某些試劑確定為關(guān)鍵試劑,關(guān)鍵試劑一般包括結(jié)合蛋白,配子(寡核苷酸,多肽鏈),抗體或標(biāo)記物等。生物分析業(yè)界沿用并擴大這一定義,包括多肽,如受體或配體,及它們的片段; 酶偶聯(lián)物; 和在某些情況下的生物基質(zhì)。
關(guān)鍵試劑管理涉及試劑采購、儲存、變更和穩(wěn)定性等各個方面,而關(guān)鍵試劑是LBA方法性能穩(wěn)定表現(xiàn)的基礎(chǔ),當(dāng)其發(fā)生變化時可能會改變方法的性能,從而影響分析結(jié)果。法規(guī)和各大指導(dǎo)原則也對關(guān)鍵試劑都提出了一些要求,在獲得關(guān)鍵試劑時,其質(zhì)量需有合適的表征和記錄,文件至少包含但不限于名稱、批號、來源、純度、濃度(如有)或滴度、親和力、分子量、儲存條件和有效期等。關(guān)鍵試劑發(fā)生改變時,須通過生物分析評估,確認(rèn)方法性能不變,保證測定結(jié)果與原關(guān)鍵試劑的一致性。
在LBA方法中,通常不可避免會引入新批號的關(guān)鍵試劑,例如原始批號的關(guān)鍵試劑使用完、試劑廠家倒閉或者不再生產(chǎn)該試劑等。避免這種情況最有效的方式是提前備足貨,保證完成整個試驗階段。然而,現(xiàn)實中更常見的是,會出現(xiàn)一些可預(yù)見或者不可預(yù)見的情況使我們不得不在項目進行中更換試劑批號或來源。這時,對關(guān)鍵試劑的變更評估是非常有必要的。我們需要預(yù)先在SOP或者項目方法方案中建立其評估方法和接受標(biāo)準(zhǔn),科學(xué)的對關(guān)鍵試劑進行變更評估。下面是評估關(guān)鍵試劑的兩個層面,包括微小變更(minor change)和重大變更(major change)。
微小變更
試劑的微小變更是對方法性能影響極小的改變,不會對數(shù)據(jù)生成產(chǎn)生影響。這些微小變更如試劑批次變更,新批次和原批次的源頭是一樣的(如:來自同一原液或者細(xì)胞系);新舊批次的制備流程也是一樣的(如:從相同動物中提取的多克隆血清進行新的一次親和純化,或者使用相同的偶聯(lián)流程對相同批次的蛋白進行一次新的偶聯(lián))。
第一個層面包含關(guān)鍵試劑中共有的測試(圖1)。單個關(guān)鍵試劑批號的變更,對于PK和biomarker分析,建議進行一個準(zhǔn)確度和精密度實驗,最好包括定量下限和定量上限在內(nèi)的5個濃度水平的質(zhì)控樣品;對于ADA分析,應(yīng)包括接近陰性質(zhì)控,高濃度和低濃度陽性對照樣品的3個濃度水平的質(zhì)控樣品。如果多個試劑批號的變更,可以使用同一方法在同一個實驗中進行資質(zhì)確認(rèn)。在這種情況下,建議進行至少2個測試,以提高測試結(jié)果的可信度。在可能的情況下,對新批次和原始批次的關(guān)鍵試劑做平行測試,對監(jiān)控分析方法性能的變化趨勢非常有用。當(dāng)然這種平行實驗不一定是必需的,也可以通過趨勢分析來考察,但不建議作為評估實驗的接受標(biāo)準(zhǔn)。在測試結(jié)果不符合接受標(biāo)準(zhǔn)的情況下,可以通過重新配制標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控樣品進行一次新的測試;如果重新測試的結(jié)果滿足接受標(biāo)準(zhǔn)通常可認(rèn)為評估完成,建議是再進行一次測試,以增加測試結(jié)果的可信度。如果重新測試的結(jié)果不滿足接受標(biāo)準(zhǔn),可能存在兩種可能性:一是制備新批次的試劑不可用;二是試劑的本身出現(xiàn)了變化,需要重新優(yōu)化方法,這種情況將視為重大變更的層面了。在沒有原始批次的關(guān)鍵試劑的情況下(圖2),對質(zhì)控的監(jiān)控就變得更加關(guān)鍵了。當(dāng)新批次關(guān)鍵試劑的測試實驗產(chǎn)生了可接受的數(shù)據(jù),其結(jié)果也可作為能夠接受試劑更換的記錄。
重大變更
試劑的重大變更是對方法性能影響極大的改變,最常見的是不能獲得原始廠家的試劑,需要更換其他廠家的同類試劑的情況;還包括從新動物獲得的新的血清,使用新的克隆株生產(chǎn)新的抗體,或使用新的細(xì)胞系表達重組蛋白等。另外還需要關(guān)注一種情況,當(dāng)ADA分析中更換新批次的陰性質(zhì)控,也可能對分析方法的性能產(chǎn)生重大影響。對關(guān)鍵試劑的重大變更也應(yīng)采取以下步驟(圖1):至少進行3個分析批測試,每一個分析批需平行測試新試劑和原始試劑。如果新試劑測試結(jié)果不滿足接受標(biāo)準(zhǔn),我們需評估測試結(jié)果失敗的原因,例如試劑結(jié)合能力或者親和力的差異導(dǎo)致原標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍不合適了;試劑與分析體系中的非特異性結(jié)合增加,使本底信號增加等等。在適用于研究目的的前提下,新的試劑還是可以使用的,但需對分析方法進行優(yōu)化和部分驗證。在沒有原始批次的關(guān)鍵試劑的情況下(圖2),新批次的關(guān)鍵試劑需要進行部分驗證,若新批次關(guān)鍵試劑的測試實驗產(chǎn)生了可接受的數(shù)據(jù),其結(jié)果也可作為能夠接受試劑更換的記錄。對于PK和biomarker分析,部分驗證包括至少3個精密度和準(zhǔn)確實驗,選擇性等;對于ADA分析,部分驗證包括至少臨界值確認(rèn),精密度,選擇性和耐藥性等。
支持新藥開發(fā)的生物分析方法可能跨越幾年,甚至十幾年,因此,我們需要在分析方法和項目生命周期管理的背景下,考慮關(guān)鍵試劑的管理。本文根據(jù)現(xiàn)有監(jiān)管機構(gòu)指南、相關(guān)白皮書,對關(guān)鍵試劑批號變更的做法及評估進行了一個簡單的總結(jié),為項目中關(guān)鍵試劑變更的問題提供參考。
參考文獻
1.King, L, et al., Ligandbinding assay critical reagents and their stability: recommendations and bestpractices from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. The AAPSjournal, 2014. 16(3): p. 504-15.2. DeSilva B, et al.
2.EBF recommendation on practical management of critical reagents for antidrug antibody ligand-binding assays. Bioanalysis. doi:10.4155/bio-2019-0248
圖1
圖片來自Lindsay E. King, et al. The AAPS Journal, Vol.16, No.3, May 2014.
圖2
圖片來自Susnne Pihl, et al. Bioanalysis, White Paper, doi:10.4155/bio-2019-0248