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一、特應(yīng)性皮炎
特應(yīng)性皮炎（Atopic Dermatitis, AD）,又稱特應(yīng)性濕疹，是一種典型的慢性炎癥性皮膚疾病，其特征在于表皮屏障功能障礙和免疫改變。在過去幾十年中，它在發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率翻了一番，15%-30%的兒童和2%-10%的成人患有AD。
AD現(xiàn)有療法多針對(duì)臨床癥狀進(jìn)行對(duì)癥治療，包括基于避免過敏原、使用保濕劑（潤(rùn)膚劑）和 局部/全身性皮質(zhì)類固醇或免疫抑制劑等治療方式，這些藥物具有一定的副作用，并且療效不持久，容易復(fù)發(fā)。目前AD尚無特異或靶向治療。研究發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)病機(jī)制涉及到表皮屏障功能受損、皮膚炎癥，如IL-13、IL-4、IL-31、IL33、IL-17、IL-23以及胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素均參與AD的進(jìn)展。隨著研究的深入，基于對(duì)AD復(fù)雜表型及發(fā)病機(jī)制更多的了解，發(fā)現(xiàn)了許多新的潛在藥物干預(yù)靶點(diǎn)，據(jù)報(bào)道目前在研的AD藥物超過70多種1。由于AD疾病患病機(jī)制較復(fù)雜，尚需更多的理論研究和臨床試驗(yàn)解析其致病脈絡(luò)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等基因組學(xué)技術(shù)因其在疾病研究、藥物開發(fā)和療效預(yù)測(cè)等方面的廣泛應(yīng)用，或可以在其中發(fā)揮重要的作用。
二、轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)發(fā)展
在人類完成基因組計(jì)劃后，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等不斷涌現(xiàn)，生命科學(xué)的研究已經(jīng)跨入后基因組時(shí)代。其中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為率先發(fā)展起來的學(xué)科是研究細(xì)胞表型和功能的重要手段，同時(shí)是研究基因表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)和功能的一個(gè)新型的研究方向。
轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）廣義上指生物體細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下所轉(zhuǎn)錄出來的RNA總和。大多數(shù)情況下轉(zhuǎn)錄組是狹義上的概念，即指信使RNA（mRNA）。mRNA通過編碼蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)將基因的遺傳信息傳遞給行使生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，與人類疾病發(fā)生關(guān)聯(lián)更密切，更引人關(guān)注。
目前轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)主要包括微陣列芯片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）以及高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（又稱“RNA-Seq” ）等。其中RNA-Seq具有通量高、靈敏度高、分辨率高等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)與芯片法和RT-PCR相比，分析不受預(yù)設(shè)引物探針限制，可檢測(cè)未知基因突變或識(shí)別新轉(zhuǎn)錄本等。
RNA-Seq測(cè)序可從整體水平上證明基因的功能和結(jié)構(gòu)，揭示疾病中特定生物過程的分子機(jī)制和相關(guān)生物標(biāo)志物。在過去的十幾年中，RNA-Seq越來越多地用于AD研究。
三、RNA-Seq在AD分子機(jī)制研究中的應(yīng)用
RNA-Seq廣泛應(yīng)用于AD的發(fā)病機(jī)制研究，尤其是相關(guān)免疫和炎癥通路，如Th1、Th2、Th17、Th22細(xì)胞極化過程的轉(zhuǎn)錄組與AD疾病進(jìn)展關(guān)系密切。為梳理AD發(fā)病機(jī)制的分子因素，以“特應(yīng)性皮炎”、“Atopic Dermatitis”、“分子”、“基因”、“轉(zhuǎn)錄組”和“RNA-Seq”等為關(guān)鍵詞檢索文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)AD致病基因大致分為三類（表1），包括編碼表皮結(jié)構(gòu)蛋白及其抑制劑的屏障相關(guān)基因，以及先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)通路相關(guān)基因2,3,4。
表1 AD相關(guān)基因
第一類：表皮發(fā)育和屏障功能相關(guān)基因。
表皮結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)基因缺陷、表皮結(jié)構(gòu)蛋白合成減少或結(jié)構(gòu)功能改變和過敏原刺激等，均可致表皮屏障受損，進(jìn)而引起機(jī)體免疫功能失常，導(dǎo)致全身性過敏性炎癥。絲聚蛋白（FLG）缺陷是導(dǎo)致皮膚屏障功能缺陷的重要因素。Palmer等發(fā)現(xiàn)，在歐洲高加索人群中，F(xiàn)LG基因失活突變與近20%AD病例有關(guān)。此外，Gutowska-Owsiak D等5 6 7通過RNA-Seq等技術(shù)揭示表皮分化復(fù)合體（EDC）、CLDN蛋白、角蛋白（KRT）等同樣與皮膚屏障損害有著密不可分的關(guān)系。
第二類：先天性免疫相關(guān)基因
皮膚上微生物群的多樣性和過度生長(zhǎng)由先天免疫系統(tǒng)感知和調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)劑抗菌肽（AMP）的失衡可能會(huì)導(dǎo)致皮膚微生物群多樣性的喪失，金黃色葡萄球菌增加，進(jìn)而刺激表皮持續(xù)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致皮膚屏障功能受損。
諸多致病因素致表皮屏障受損后，外源性變應(yīng)原進(jìn)入表皮，被皮膚樹突狀細(xì)胞(DCs)識(shí)別、呈遞并誘導(dǎo)隨后的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致系統(tǒng)性過敏性疾病的發(fā)生（圖1）。Oyoshi等通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)，皮膚屏障功能受損后，受損區(qū)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞釋放胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP) 8，后者激活DCs，刺激T細(xì)胞向Th2 等細(xì)胞的極化，引起過敏性炎癥反應(yīng)。
圖1 AD遺傳機(jī)制9
第三類：適應(yīng)性免疫相關(guān)基因
一般觀點(diǎn)認(rèn)為，AD的發(fā)展主要依賴于Th2淋巴細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)，其他 T 細(xì)胞亞群 （Th1、 Th17 和 Th22）起輔助作用。Julia K. Gittler等10通過RNA-seq、免疫組化等技術(shù)研究皮損組織的細(xì)胞因子表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)AD發(fā)病具有雙向免疫模式，Th2 反應(yīng)在急性期和慢性期AD 損傷中均居主導(dǎo)地位，Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，在慢性AD 損傷中扮演重要角色。
其中，AD主要發(fā)病機(jī)制為皮損處Th2相關(guān)細(xì)胞因子如IL-4和IL-13、趨化因子如TARC(胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子)和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等控制。IL-4和IL-13通過降低角質(zhì)形成細(xì)胞終末分化、降低表皮屏障蛋白表達(dá)及增加TSLP，從而導(dǎo)致屏障功能障礙。此外，IL-4和IL-13可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌等致病菌的定植增加，進(jìn)而影響表皮屏障功能。
1999年Elias 11提出皮炎分子機(jī)制的“Outside-in”假說（圖2），認(rèn)為皮膚屏障受損早在AD 發(fā)病前就存在，是導(dǎo)致機(jī)體免疫失常的啟動(dòng)因素。表皮結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)基因缺陷等引發(fā)表皮屏障受損，引起免疫功能失常和炎癥發(fā)生。這就是AD 發(fā)病的遺傳及獲得性皮膚屏障功能失常假說。近些年有學(xué)者提出“Inside-out ”假說，認(rèn)為先有免疫炎癥，再有皮膚屏障功能失常。表皮屏障和免疫失常的前后順序目前無法定論，精確作用機(jī)制尚需更多證據(jù)的指出。
圖2 AD發(fā)病機(jī)制之“Outside-in”和“Inside-out”假說
熙寧生物現(xiàn)推出RNA-Seq測(cè)序服務(wù)，可全面分析組織、血液、石蠟包埋切片（FFPE）等樣本的mRNA表達(dá)情況，進(jìn)行基因差異表達(dá)分析、差異基因功能和通路注釋、可變剪切變異分析和新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)分析等，出具完整全面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告，助力申辦方開展藥物作用機(jī)制研究和生物標(biāo)志物研究。熙寧生物采用KAPA建庫試劑進(jìn)行mRNA富集和文庫構(gòu)建，保證文庫質(zhì)量和數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，配備CN500測(cè)序儀完成上機(jī)測(cè)序，可在5個(gè)工作日內(nèi)完成樣本分析全流程。
1.實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線
2.生信技術(shù)路線
3.性能展示
（1）準(zhǔn)確度/精密度
將RNA標(biāo)準(zhǔn)品Spike-in至皮膚組織total RNA，進(jìn)行3批RNA-Seq檢測(cè)，結(jié)果均與預(yù)期相符，9個(gè)差異表達(dá)基因可100%檢出（紅色圓點(diǎn)）。
閾值設(shè)置：｜Log2fold change｜≥1，p＜0.05
圖3 RNA標(biāo)準(zhǔn)品RNA-Seq測(cè)序的火山圖
（2）準(zhǔn)確度
RNA-Seq與qPCR（Taqman探針法）結(jié)果符合度高，R2>0.9700。
（3）案例展示
植物血凝素（PHA）刺激導(dǎo)致T細(xì)胞增殖，將引起相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。根據(jù)mRNA表達(dá)圖譜，部分T細(xì)胞增殖相關(guān)mRNA顯著上調(diào)（方框），與預(yù)期相符。
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