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寡核苷酸藥物（Oligonucleotide）是一類由幾十個核苷酸組成的，序列較短的核酸分子。其主要是通過基因沉默抑制靶蛋白的表達(dá)，從而實現(xiàn)治療疾病的目的。
與傳統(tǒng)藥物相比，寡核苷酸藥物具有多重技術(shù)優(yōu)勢，包括：（1）特異性高；（2）高效性；（3）長效性，降低給藥頻率；（4）研發(fā)周期短，臨床轉(zhuǎn)化與研發(fā)成功率相對較高；（5）靶點豐富，適應(yīng)癥廣等。目前人工合成的寡核苷酸藥物分類如圖1所示。其中反義寡核苷酸（ASOs）、小干擾 RNA（siRNA）為臨床中開發(fā)的寡核苷酸藥物的主要形式。
全球首款反義核酸藥物于1998年獲批上市，開啟了寡核苷酸藥物上市的征程；全球首款siRNA藥物Patisiran于2018年獲批上市，更具有里程碑意義；近兩年來已有四款siRNA藥物陸續(xù)獲批上市。截止目前，據(jù)統(tǒng)計全球已有超16款寡核苷酸藥物獲批上市，有超過400個化合物處于研發(fā)階段。2023年，諾華研發(fā)的siRNA長效降脂藥--英克司蘭鈉注射液（lnclisran）在中國獲批上市。與PCSK9單抗相比，英克司蘭鈉在給藥頻率和患者用藥成本方面都顯示出了更大的優(yōu)勢，因此具有極高的性價比。此外，2023年年底瑞博生物與齊魯制藥簽訂授權(quán)協(xié)議共同推進(jìn)抗PCSK9小核酸新藥的開發(fā)與商業(yè)化。2024年新年伊始，瑞博再次傳來好消息，與勃林格殷格翰攜手共同開發(fā)小核酸創(chuàng)新療法，未來必將掀起寡核苷酸藥物研發(fā)熱潮。
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目前寡核苷酸生物分析方法主要有定量PCR、雜交免疫、免疫熒光以及質(zhì)譜檢測等。定量PCR主要適用于分子量在25 mer以上的藥物，其檢測靈敏度可以到達(dá)pg/fg級別，特別適合給藥劑量低，靈敏度要求高的項目；雜交免疫和免疫熒光適用于分子量在20-40mer左右的藥物，雜交免疫一般靈敏度可以達(dá)到0.1ng/mL附近，免疫熒光一般靈敏度可以達(dá)到單位ng級別；質(zhì)譜檢測受限于前側(cè)原理和分子量大小，主要適用于ASO和siRNA類型的藥物，分子量在20 mer以下，其檢測靈敏度約為0.5~5ng/mL。
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1. 樣品前處理
液液萃取法（LLE）是提取寡核苷酸最常見的一種方式，比較常用的萃取劑為苯酚-氯仿。在此基礎(chǔ)上也可以進(jìn)行優(yōu)化，比如加入異丙醇進(jìn)行沉淀，去除基質(zhì)中的蛋白，降低基質(zhì)效應(yīng)。同時也需要根據(jù)化合物性質(zhì)，調(diào)節(jié)pH值，比如加入氨水等，來提高寡核苷酸藥物在水相中的溶解性。
固相萃取法（SPE）是提取寡核苷酸使用最廣泛的處理方式。固相萃取的方法與色譜分離的原理相同，由于寡核苷酸藥物極性很大，保留差，在固相小柱活化和淋洗的過程中均需要使用離子對試劑緩沖液，才能達(dá)到保留寡核苷酸和洗脫干擾基質(zhì)的目的。目前市面上也有非常成熟的提取寡核苷藥物的試劑盒，例如Clarity?OTX?萃取方案可有效去除掩蓋目標(biāo)寡核苷酸并影響分析結(jié)果的細(xì)胞碎片，包括蛋白質(zhì)、基因組DNA和脂質(zhì)。通過去除這些污染物，MS基線噪音可顯著降低，從而簡化定量生物分析的過程。但是SPE方法成本高，主要適用于組織樣品提取過程中。
此外，寡核苷酸在聚丙烯管和玻璃容器中均存在非特異性吸附，這嚴(yán)重影響檢測重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度，因此可以加入表面活性劑來降低或者消除這一影響。在前處理過程中選擇合適的耗材和試劑，例如無RNA/DNA酶的槍頭、離心管和純水等，對于實驗結(jié)果也會產(chǎn)生較大的影響。
2. 色譜分離
寡核苷酸屬于酸性強(qiáng)極性化合物，在一般色譜柱上很難保留。針對寡核苷酸色譜法主要有離子對反相色譜（IP-RPLC）、離子交換色譜（IEC）、親水作用色譜（HILIC）。其中離子對反相色譜法最為常用，主要使用離子對試劑，其原理是帶正電的離子對試劑會與帶負(fù)電的寡核苷酸磷酸骨架在溶液中構(gòu)成離子對，減少了寡核苷酸的凈電荷并增加了其疏水性，此時疏水相互作用促成了寡核苷酸在離子對反相色譜中的保留；再者，離子對試劑依靠其疏水性烷基鏈可以吸附于反相色譜的固定相上以形成離子交換劑（Ion exchanger），此時靜電相互作用將幫助寡核苷酸在反相色譜中的保留。離子對試劑的種類繁多，最常用離子對主要為基于乙酸胺試劑和基于六氟異丙醇（HFIP）的胺類離子對試劑。
3. 質(zhì)譜檢測
寡核苷酸由于其特殊結(jié)構(gòu)，每個磷酸二酯鍵上都帶有1個酸性質(zhì)子（PKa~1），這類化合物在ESI源負(fù)離子模式下響應(yīng)較好。由于寡核苷酸含有多個核苷酸基團(tuán)，在ESI源中發(fā)生去質(zhì)子反應(yīng)，在負(fù)離子模式下形成多重電荷離子，同時很容易結(jié)合金屬離子，因此會分散質(zhì)譜信號。此外隨著寡核苷酸分子量的增加，其檢測響應(yīng)也會損失嚴(yán)重。因此對這類化合物需要優(yōu)化質(zhì)譜條件，改善多電荷分布，同時減少待測物在質(zhì)譜分析加合離子形成。主要通過調(diào)節(jié)溶液pH值、陽離子濃度和有機(jī)溶劑組成，來消除或者降低上述因素的影響。在色譜分離中已經(jīng)提及需要使用到離子對試劑，以及在一開始的方法開發(fā)階段尋找子母離子也必須使用離子對試劑，否則很難找到對應(yīng)的子母離子碎片，然后在此條件下再進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，可能會獲得比較好的信號響應(yīng)。
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目前在siRNA和ASO檢測中，檢測的基質(zhì)類型主要有血漿、尿液、糞便和組織。不同的基質(zhì)類其前處理方法影響很大，血漿樣品主要使用LLE法即可輕松達(dá)到1-5ng/mL，尿液需要重點考慮非特異性吸附、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率的影響，可以使用表面活性劑減低吸附，調(diào)節(jié)樣品pH值和引入蛋白（血漿或血清）來提高回收率。組織中藥物檢測對方法要求很高，組織樣品一般在提取前需要加入蛋白酶K分解組織，組織提取液具有很強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)和低提取回收率，目前常規(guī)使用SPE的方法來解決相關(guān)問題，但SPE在貨期和成本方面不具優(yōu)勢。熙寧生物|精翰生物目前開創(chuàng)性使用LLE法檢測組織中的藥物濃度，其靈敏度可以達(dá)到10-20ng/mL，從耗材貨期和成本，以及方法重現(xiàn)性等方面與SPE相比，有很大優(yōu)勢，完全滿足組織樣品的檢測需求。此外組織檢測中離子對選擇對檢測結(jié)果，特別是基質(zhì)效應(yīng)影響很大，需要優(yōu)化質(zhì)譜條件選擇合適的離子對。
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熙寧生物|精翰生物擁有臨床前、質(zhì)譜平臺、免疫分析平臺、PCR平臺等完備的技術(shù)平臺，可以為寡核苷酸藥物的生物分析提供從藥效學(xué)、藥代動力學(xué)、免疫原性、細(xì)胞因子到生物標(biāo)志物檢測的一體化服務(wù)。
目前，熙寧生物|精翰生物遵循GLP、GCP 和 GCLP 體系要求，服務(wù)藥企寡核苷酸藥物的分析需求。我們已憑借完備的技術(shù)平臺支持了多個寡核苷酸藥物的臨床前和臨床項目，涵蓋病毒性疾病、心血管疾病、炎癥類疾病、代謝類疾?。ㄌ悄虿。┑戎T多治療領(lǐng)域，在寡核苷酸藥物的生物分析上積累了豐富的經(jīng)驗，能夠為客戶提供極具性價比的解決方案。一直以來，熙寧生物|精翰生物致力于與客戶緊密合作，共同推動藥物成功上市，造福全球病患。我們堅信，通過不懈努力和不斷創(chuàng)新，我們可以為這一目標(biāo)貢獻(xiàn)一份重要的力量。
