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靶向蛋白質(zhì)降解(TPD)目前主要通過泛素蛋白酶體和溶酶體降解目標(biāo)蛋白，根據(jù)具體作用原理又可細分為近10個不同技術(shù)路線，其中發(fā)展最快的是分子膠和PROTAC技術(shù)。
圖1 靶向蛋白質(zhì)降解(TPD)不同的技術(shù)路線
分子膠 VS PROTAC：
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分子膠不需要與POI存在親和力。
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分子膠在成藥性上優(yōu)于PROTAC。
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分子膠大多數(shù)是偶然發(fā)現(xiàn)的，而PROTAC可以通過合理設(shè)計實現(xiàn)。
圖2 分子膠 VS PROTAC
PART 01
全球范圍內(nèi)分子膠和PROTAC藥物研發(fā)情況概覽
全球分子膠藥物研發(fā)情況
目前研發(fā)的新藥大多通過E3的組成分子CRBN來降解蛋白質(zhì)，主要用于MM、血液系統(tǒng)腫瘤和實體惡性腫瘤等疾病治療。從作用機制來看，IKZF1/3是其中最熱門的作用靶點，GSPT1、DCAF15、IKZF2、BCL-xL、SEL1L2等新靶點也陸續(xù)被開發(fā)。
圖3 全球分子膠藥物研發(fā)情況（不完全統(tǒng)計）
全球PROTAC藥物研發(fā)情況
圖4 全球PROTAC藥物研發(fā)情況（不完全統(tǒng)計）
PART 02
流式細胞術(shù)在分子膠和PROTAC藥物PD檢測中的應(yīng)用
流式細胞術(shù)在SP-3164 PD研究中的應(yīng)用
SP-3164是一種阿伐度胺（AVA, CC-122）的氘穩(wěn)定（S）對映異構(gòu)體，同時也是一種可口服的分子膠，用于降解Ikaros和Aiolos（I/A）。相關(guān)體外研究數(shù)據(jù)表明其在多發(fā)性骨髓瘤臨床前模型中具有活性，與來那度胺（LEN）、泊馬度胺（POM）和阿伐度胺（AVA）相比，SP-3164更有效、更快速地降解促癌轉(zhuǎn)錄因子I/A，而穩(wěn)定的（R）-對映異構(gòu)體SP-3165既不結(jié)合CRBN也不降解I/A。在初步的體內(nèi)研究中，SP-3164產(chǎn)生了顯著的腫瘤生長抑制（TGI）。
將SP-3164降解MM.1S細胞中Aiolos的潛力與SP-3165、AVA和POM進行了比較。SP-3164以時間和劑量依賴性方式快速而有力地降解Aiolos，比AVA和POM更有效，而SP-3165表現(xiàn)出最弱的Aiolos降解。為了研究SP-3164對細胞存活的影響，用SP-3164（0.1μM、1μM和10μM）和SP-3165（1μM）處理NCI-H929細胞，并通過流式細胞術(shù)評估細胞凋亡。SP-3164在72小時后誘導(dǎo)劑量依賴性早期和晚期細胞凋亡，而SP-3165未誘導(dǎo)細胞凋亡。在NCI-H929小鼠異種移植模型中評估SP-3164的體內(nèi)活性并與SP-3165、LEN和POM進行比較。SP-3164作為單一藥物顯示出顯著的TGI，而SP-3165似乎支持腫瘤生長。LEN和POM表現(xiàn)出最弱的TGI。與POM+DEX聯(lián)合使用相比，SP-3164與地塞米松（DEX）聯(lián)合使用時，TGI有所改善。
同時，SP-3164可以有效降解Ikaros和Aiolos（I/A），在臨床前NHL模型中顯示出令人信服的活性。
流式細胞術(shù)在NVP-DKY709 PD研究中的應(yīng)用
NVP-DKY709，一種IKZF2（Helios）轉(zhuǎn)錄因子的選擇性降解物，不降解IKZF1/3。研究表明，NVP-DKY709在體外可降低人調(diào)節(jié)性T細胞的抑制作用，并使耗竭Teff分泌細胞因子，降低小鼠的腫瘤生長，并降解猴子和人體內(nèi)的IKZF2。
① 通過流式細胞術(shù)體外評估DKY709對T細胞和Tregs細胞的影響。
圖5 A．D&E的圈門策略； B．人原代Treg細胞體外孵育10μM DKY709或DMSO的數(shù)據(jù)，包括%IKZF2+和IKZF2 MFI；C．人原代Treg細胞在DKY709作用下會擴增，并抑制Teff細胞增殖；D&E不同濃度DKY709作用于重復(fù)TCR刺激誘導(dǎo)的功能失調(diào)的Teff細胞，IKZF2+以及IL-2和IFN-γ水平的變化
② 通過流式細胞術(shù)評估小鼠和食蟹猴給藥DKY709對T細胞和Tregs細胞的影響。
圖6 A. B的圈門策略；B. 通過流式細胞術(shù)測定單次口服DKY709后食蟹猴血液中Treg細胞中IKZF2水平；C. 每日給予KLH免疫的食蟹猴指定劑量的DKY709后，通過流式細胞術(shù)測定外周血CD3+細胞中Ki67的表達水平來評估外周血T細胞的增殖能力
圖7 A. B&C的圈門策略；B. 人源化小鼠MDA-MB-231腫瘤移植模型中IKZF2在原代Foxp3+ Treg細胞中的體內(nèi)降解，血液(左)和腫瘤浸潤(右)；C. 通過流式細胞術(shù)評估DKY709和PD1阻斷治療對腫瘤浸潤性Treg細胞Foxp3 MFI和CD25表達和增殖的影響
③ 通過流式細胞術(shù)評估臨床DKY709藥效
圖8 通過流式細胞術(shù)評估兩例在指定時間內(nèi)每天接受20mg DKY709患者外周血Tregs中IKZF2的水平
流式細胞術(shù)在ARCC-29 PD研究中的應(yīng)用
ARCC-29是一種蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）分子，它通過蛋白酶體誘導(dǎo)BET（BRD4/3/2）蛋白降解。ARCC-29 在幾種人類惡性細胞系和體內(nèi)嚙齒動物異種移植腫瘤中降解BRD4。在前列腺（22Rv1）、DLBCL（SU-DHL-6）和卵巢（A2780）腫瘤的小鼠異種移植模型中，該分子表現(xiàn)出很強的PK/PD/療效關(guān)系。從患者身上獲取腫瘤組織通常需要侵入性操作，并且可能無法獲得。已有相關(guān)研究開發(fā)了一種使用替代組織的檢測方法來評估PROTAC的作用機制，這些機制可以應(yīng)用于臨床，通過流式細胞術(shù)來定量評估外周血單核細胞（PBMC）各亞群中BRD4的水平。將冷凍或新鮮的人PBMC與ARCC-29離體培養(yǎng)6小時，固定并透化以進行細胞內(nèi)BRD4染色，并在門控淋巴細胞中定量BRD4水平。ARCC-29在四個新鮮PBMC樣品中將BRD4水平降低到對照的13%、10%、16%和9%，在六個冷凍PBMC樣品中降低到10%、9%、11%、6%、8%和35%，與BRD4抑制劑OTX-015作用PBMC顯示出相似或更強的抑制作用。流式細胞術(shù)檢測PBMC為治療前和治療后的患者樣本在臨床上確認PROTAC的作用機制提供了潛在的替代方法。
PART 03
熙寧生物|精翰生物凍存全血專利助力分子膠和PROTAC藥物臨床PD檢測
表1 FACS熙寧|精翰部分凍存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)展示
凍存穩(wěn)定性總結(jié)：
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-70℃凍存3個月，與基線相比，各亞群的靶蛋白1的抑制率%CV范圍為：2.8%-13.6%。
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-70℃凍存3個月，與基線相比，各亞群的靶蛋白2的抑制率%CV范圍為：7.5%-11.5%。
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-70℃凍存3個月，與基線相比，各亞群的占比%CV范圍為：0.5%-7.8%。
圖9 各細胞亞群抑制率（％）
FACS熙寧|精翰部分臨床樣品數(shù)據(jù)展示。分別在給藥前D1-Pre，給藥后各時間點檢測全血樣品中各細胞亞群靶蛋白抑制率，給藥后有明顯抑制
表2 FACS檢測胞內(nèi)/核內(nèi)因子相關(guān)案例經(jīng)驗
熙寧|精翰生物流式平臺，不斷進行技術(shù)迭代，開發(fā)創(chuàng)新。針對流式分析血液樣品穩(wěn)定性時間短，需要及時運輸；或者是需要在臨床中心分離PBMC，耗時耗力，效果不佳等行業(yè)痛點，開發(fā)了全血直接凍存技術(shù)，目前已獲得國家專利授權(quán)，提高了各方的運營效率，減小了數(shù)據(jù)的批間差異，提高了數(shù)據(jù)的可比性，為行業(yè)創(chuàng)造了價值，受到了來自申辦方和臨床試驗中心的一致歡迎和好評；為國際多中心臨床樣品的流式檢測，提供了解決方案。基于全血凍存技術(shù)，熙寧|精翰開展了一系列的應(yīng)用拓展，包括但不限于：
基于凍存全血的靶點降解檢測
穩(wěn)定性預(yù)計至少3個月
基于凍存全血的淋巴細胞亞群比例檢測
穩(wěn)定性可達12個月；
基于凍存全血的淋巴細胞亞群比例和
絕對計數(shù)檢測
穩(wěn)定性預(yù)計可達至少6個月
基于凍存全血的受體占位檢測
（受體占位靶點包括PD-1,PD-L1, TIGIT, PVRIG, CD19,CD20, CD33, CD38, CD39, CD47, CD73等）
穩(wěn)定性可達6-12個月
熙寧|精翰流式細胞團隊由30余名經(jīng)驗豐富的人員組成，配備BD流式細胞儀、Beckman流式細胞儀、Cytek光譜流式細胞儀等儀器和設(shè)備，支持過包括抗體類藥物、基因與細胞治療藥物、小分子創(chuàng)新藥等各類新藥的流式分析檢測，其中抗體藥物>40個，基因與細胞治療藥物>50 個，小分子創(chuàng)新藥>20 個，臨床試驗>100 個，更是支持國內(nèi)第一款I(lǐng) 類新藥的CAR-T產(chǎn)品- 藥明巨諾倍諾達?（瑞基奧侖賽注射液）的樣本檢測分析工作。平臺能夠支持包括免疫細胞亞群分型檢測，細胞治療產(chǎn)品的PK/PD 分析，抗體藥物的受體占位分析，PD指標(biāo)蛋白磷酸化、甲基化、乙?；瘷z測，胞內(nèi)因子檢測等。尤其在血液腫瘤淋巴細胞亞群檢測中具有大量的實戰(zhàn)經(jīng)驗，歡迎咨詢溝通。
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