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呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是全球范圍內(nèi)引起嬰幼兒、免疫缺陷人群及老年人急性下呼吸道疾病（Acute Lower Respiratory Tract Infections，ALRTIs）的主要病原體之一，具有高度傳染性和致病性，嚴重時會導致患者支氣管炎、肺炎和哮喘的發(fā)生，給家庭造成了嚴重的疾病和經(jīng)濟負擔。
研發(fā)有效的RSV疫苗成為預防RSV感染的重要手段之一，此前數(shù)十年間，科學家們不曾停止對于RSV疫苗的研究與開發(fā)，但均以失敗告終。2023年，F(xiàn)DA相繼批準了葛蘭素史克（GSK）的Arexvy和輝瑞（Pfizer）的Abrysvo兩款RSV疫苗，用于預防60歲及以上人群中由呼吸道合胞病毒（RSV）引起的下呼吸道疾病，實現(xiàn)了RSV疫苗和藥物開發(fā)領域近60年來里程碑式的突破。
PART 01
Pre-F蛋白為RSV疫苗研發(fā)的關鍵抗原
關鍵抗原的選擇是RSV疫苗研發(fā)成功的關鍵，F(xiàn)蛋白和G蛋白對RSV病毒的黏附和入侵十分重要，也是病毒表面的主要保護性抗原，二者都可以成為RSV研發(fā)的理想靶點。然而由于G蛋白變異較多相對不穩(wěn)定，基于Pre?F蛋白的RSV疫苗具有較高的安全性和免疫原性，適用于兒童、孕婦、成人和老年人群。
F蛋白具有黏附和融合功能，可介導病毒粒子進入細胞，形成合胞體。在RSV感染過程中，F(xiàn) 蛋白首先采用亞穩(wěn)態(tài)的融合前F 蛋白（ Pre-fusion Protein，Pre-F） 表達在病毒包膜表面，當與宿主細胞膜接觸后，結(jié)構(gòu)重排為高度穩(wěn)定的融合后F 蛋白（ Post-fusion Protein，Post-F），存在Pre-F和Post-F構(gòu)象變化。
圖1 RSV Pre-F和Post-F蛋白結(jié)構(gòu)和抗原位點[1]
Pre?F蛋白具備6 種抗原表位，即SiteⅠ、II、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、?，而Post?F僅包含Pre?F的前4種表位。研究表明，可誘導更強中和抗體活性的抗原表位Site Ⅴ和Site ?均位于Pre?F蛋白中，尤其是Site ?誘導的中和抗體活性最高（位于Pre?F頂端）。因此，誘導高滴度的中和抗體是開發(fā)RSV疫苗的主要目標，血清中大多數(shù)RSV中和活性僅針對Pre?F抗原位點，具有特異性抗原表位的Pre?F蛋白則成為最熱門的RSV疫苗靶標。
PART 02
RSV疫苗臨床進展
RSV疫苗的開發(fā)始于1957年首次在人類中發(fā)現(xiàn)RSV病毒后不久。1960年代便開發(fā)了FI-RSV疫苗，并在嬰兒身上進行了臨床試驗。疫苗病毒通過細胞培養(yǎng)產(chǎn)生，用福爾馬林滅活，并與明礬混合作為佐劑。然而，F(xiàn)I-RSV主要表達Post-F構(gòu)象而非Pre-F構(gòu)象，該疫苗不僅未能保護血清陰性的嬰兒免受RSV的侵害，還誘發(fā)嚴重的增強型呼吸道疾?。‥nhanced Respiratory Disease，ERD），導致80%的受試嬰兒住院治療，并導致2人死亡。ERD的部分原因為福爾馬林導致疫苗制劑中和表位的破壞，F(xiàn)I-RSV注射可導致免疫紊亂，表現(xiàn)為CD4+T細胞數(shù)量和Th2細胞因子水平增加，同時，CD8+T細胞數(shù)量和Th1細胞因子水平降低，可能也有助于ERD。因此，在血清陰性兒童中開發(fā)滅活疫苗和蛋白質(zhì)疫苗時，必須考慮ERD發(fā)展的潛在風險?；诖擞绊?，RSV疫苗的開發(fā)推遲了幾十年，目前有五種類型的RSV疫苗正在開發(fā)中，即基于顆粒的、基于載體的、減毒活疫苗或嵌合疫苗、亞單位疫苗和mRNA疫苗。
圖2 RSV免疫策略[2]
圖3 RSV疫苗臨床進展[2]
Arexvy
2023年5月4日，F(xiàn)DA批準葛蘭素史克公司的RSV疫苗Arexvy上市，用于預防60歲及以上人群因感染RSV引發(fā)的下呼吸道疾?。↙RTD），這是全球首款獲批用于老年人的RSV疫苗，Arexvy由穩(wěn)定的pre-F與AS01佐劑組成。
基于AReSVi-006關鍵性III期試驗結(jié)果，Arexvy對60歲及以上成人的RSV-LRTD的保護效力為82.6%，具有顯著的統(tǒng)計學和臨床意義，達到試驗主要終點。在至少患有一種基礎疾?。ㄈ缧难芗膊『蛢?nèi)分泌代謝疾?。┑睦夏耆酥?，該疫苗的保護力為94.6%。對于重度RSV-LRTD患者（即因RSV-LRTD妨礙日常活動的患者），其保護效力為94.1%。
Abrysvo
2023年6月1日，輝瑞宣布其RSV二價疫苗Abrysvo獲得FDA批準，用于預防60歲及以上成人由RSV引起的LRTD。該疫苗是一種非佐劑二價疫苗，含有來自RSV-A和RSV-B的穩(wěn)定pre-F蛋白亞基。
Abrysvo III期臨床試驗RENOIR數(shù)據(jù)顯示，Abrysvo在預防至少有兩種癥狀的RSV-LRTD方面的有效率為66.7%，在預防有三種或以上癥狀感染方面的有效率為85.7%。此外，這項研究還表明，針對融合前形式蛋白的特異性抗體在阻斷病毒感染方面非常有效，這表明基于Pre-F蛋白的疫苗可能對RSV起到最佳保護作用。
除60歲及以上人群外，新生兒同樣為弱勢群體，Abrysvo開發(fā)了另一個適應癥：通過孕婦的主動免疫預防剛出生至6個月大的嬰兒中由RSV引起的下呼吸道疾病和嚴重下呼吸道疾病。即通過給孕婦注射疫苗，降低新生嬰兒的感染風險，此前，F(xiàn)DA已批準了Abrysvo的BLA優(yōu)先審評。
圖4 Abrysvo疫苗母體和嬰兒血清中RSV-A、RSV-B中和抗體滴度檢測[4]
2024年4月9日，輝瑞宣布其研究開發(fā)的RSV疫苗（ Abrysvo） 的一項III期臨床研究獲得積極結(jié)果，透露出Abrysvo將有望用于18~59歲的成人因呼吸道合胞病毒引起的下呼吸道疾?。≧SV-LRTD）的積極信號，有望成為全球首款針對18歲及以上成年人的RSV疫苗。
mRNA疫苗
mRNA可以通過設計編碼序列來編碼穩(wěn)定的F蛋白構(gòu)象，編碼天然RSV F蛋白或穩(wěn)定的Pre-F構(gòu)象的mRNA疫苗也通過使用陽離子納米顆粒和LNP成功遞送。莫德納開發(fā)并正在評估三種編碼pre-F蛋白的單劑量候選疫苗，即用于成人的mRNA-1172和mRNA-1777，以及用于兒童的mRNA-1345。
圖5 RSV mRNA疫苗臨床進展[1]
mRNA-1777（V171）疫苗包含經(jīng)化學修飾RSV pre-F的mRNA和使用了與莫德納COVID-19 mRNA疫苗相同的脂質(zhì)納米粒（LNP）。臨床I期研究在72名健康的年輕人（≥18歲，≤49歲）和107名健康的老年人（年≤60歲，≤79歲）中進行，參與者接受25，100，200或300 μg mRNA-1777（V171）或安慰劑作為單一肌肉注射劑量，主要目標是評估安全性和耐受性，次要目標評估體液和細胞介導的免疫原性。結(jié)果顯示，所有劑量水平的mRNA-1777（V171）耐受性良好，未報告與疫苗相關的嚴重不良事件。
通過血清RSV A、RSV B中和抗體滴度，血清RSV Pre-F蛋白抗體滴度，血清RSV Pre-F蛋白D25競爭性抗體滴度等檢測，mRNA-1777疫苗可引起有效的體液免疫應答。通過FACS和ELISPOT檢測細胞對RSV-F多肽的免疫反應，與mRNA-1777疫苗RSV-F蛋白相關的T細胞反應也有所增加，并且主要與CD4+ T細胞亞群相關。
圖6 mRNA-1777 （V171）疫苗特異性T細胞反應（IFN-γ ELISPOT檢測，A 年輕人，B老年人）[5]
圖7 mRNA-1777 （V171） 胞內(nèi)細胞因子檢測（FACS，A 年輕人，B老年人）[5]
mRNA-1345疫苗基于mRNA-1777進一步進行序列設計和密碼子優(yōu)化，以增強抗原的翻譯表達和激活的免疫原性。臨床試驗結(jié)果顯示，在老年人中，單次接種 mRNA-1345（50、100 或 200 μg）可使針對 RSV-A 的中和抗體滴度提高 14 倍，RSV-B提高10 倍，且老年人對疫苗的耐受性良好?；诖藬?shù)據(jù)，F(xiàn)DA已授予mRNA-1345用于60歲及以上老年人群的快速通道資格（FTD），mRNA-1345目前處于III期臨床試驗階段。
PART 03
RSV疫苗臨床生物分析內(nèi)容
隨著越來越多的RSV疫苗獲批上市和進入臨床階段，RSV疫苗的評價方法也越來越重要。RSV疫苗產(chǎn)品的臨床生物分析主要包括RSV中和抗體、結(jié)合抗體、RSV病毒載量以及細胞免疫等內(nèi)容。
圖8 RSV疫苗檢測的四種方法[6]
RSV中和抗體是RSV疫苗臨床評價的重要指標。傳統(tǒng)的中和抗體檢測方法為噬斑減少中和試驗（Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT）和微量細胞中和試驗，此外，基于ELISA、ELIspot等技術(shù)的中和抗體檢測方法可通過針對病毒蛋白的抗體對感染細胞中病毒蛋白進行檢測，具有簡單、快速、高通量和高度敏感性等優(yōu)勢，且在多種RSV疫苗和預防性抗體的中和抗體檢測中均有適用。
圖9 RSV中和抗體檢測方法[7]
PART 04
結(jié)語
熙寧生物|精翰生物以分析科學為核心能力，為新藥臨床與臨床前研究提供專業(yè)技術(shù)服務。在疫苗臨床研究領域，我們擁有完善的檢測平臺和一站式檢測服務能力，開發(fā)了基于ELISA、Fluorescence、Luminescence高通量的中和抗體評估方法，具有基于ELISpot、ICS的細胞免疫檢測能力，支持中美、中澳、多中心、大樣本量的臨床試驗，有著豐富的海外樣品進口經(jīng)驗。
熙寧生物|精翰生物在RSV臨床研究領域的項目檢測經(jīng)驗非常豐富，可提供一體化、高效率的臨床生物分析服務，包括：
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細胞學方法進行血清中RSV-A和RSV-B中和抗體滴度檢測
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ELISA/MSD方法進行血清中RSV 抗F蛋白的特異性抗體濃度檢測
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RT-qPCR方法進行RSV病毒載量檢測
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ELISPOT方法進行RSV抗原多肽特異性T細胞反應檢測
熙寧生物|精翰生物可高效助力RSV疫苗和藥物領域臨床研究的開展，歡迎大家后臺留言咨詢交流。
