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根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)，癌癥是全球人口死亡的第二大原因，每年近千萬人死于癌癥。由于具有高抗腫瘤特異性和較低的毒副作用等優(yōu)良特性，雙特異性抗體(bsAbs)和抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)已經(jīng)成為癌癥治療中的熱門藥物。目前，超過100種雙抗和ADC候選藥物正在接受臨床評估。隨著眾多藥企的加入，雙抗和ADC的研發(fā)賽道競爭激烈，產(chǎn)品靶點同質(zhì)化嚴(yán)重。在此背景下，開發(fā)出高效且具有差異化的產(chǎn)品成為藥企們破局的關(guān)鍵，雙抗ADC（bsADCs）應(yīng)運而生。
PART 01
雙抗ADC藥物
雙抗ADC藥物是一種將小分子細(xì)胞毒素（payload）通過連接子（linker）與雙特異性抗體偶聯(lián)形成的藥物，能夠有效將細(xì)胞毒性藥物靶向遞送到癌細(xì)胞區(qū)域，達到精準(zhǔn)治療的效果（圖1）。雙抗ADC可分為雙靶點ADC（如EGFR/HER3 ADC）和雙表位ADC（如HER2/HER2 ADC）兩大類。相較于單抗ADC，雙抗ADC的優(yōu)勢主要在于：
·
雙靶點增強腫瘤靶向特異性，降低脫靶引起的副作用；
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雙抗ADC產(chǎn)生新的結(jié)合和內(nèi)吞動力學(xué)機制，增強殺傷效果；
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雙抗ADC靶向雙腫瘤驅(qū)動信號通路，克服因單靶點表達下降而產(chǎn)生的耐藥性問題。
圖1 雙抗ADC的作用機制示意圖
截至目前，全球范圍內(nèi)共有15款A(yù)DC藥物獲批上市，均為單抗ADC。雙抗ADC尚處于發(fā)展階段，臨床的在研產(chǎn)品數(shù)量比較有限。據(jù)統(tǒng)計，目前處于臨床階段的雙抗ADC項目有近10項，國內(nèi)國外各占50%左右（表1）。其中百利天恒的BL-B01D1（EGFR/HER3 ADC）臨床進展領(lǐng)先（II期），展現(xiàn)出優(yōu)異的臨床治療潛力，并于近期與BMS達成獨家許可與合作協(xié)議，成為首款成功出海的雙抗ADC藥物，項目交易首付款8億美元，潛在交易總額84億美元，刷新了我國創(chuàng)新藥出海的記錄。此外，國內(nèi)其他廠商也積極布局雙抗ADC，開發(fā)相應(yīng)的技術(shù)平臺，如康寧杰瑞的糖定點偶聯(lián)平臺、百奧賽圖的RenLite全人抗體小鼠平臺和康源久遠的聚乙二醇雙抗ADC平臺（P-BsADC）等。雙抗ADC的研發(fā)正形成國內(nèi)國外雙頭并進、百花齊放的格局，未來將有越來越多的雙抗ADC藥物走進臨床、申請上市，為病患帶來曙光。
表1 雙抗ADC全球在研項目
然而，開發(fā)雙抗ADC藥物的道路仍然布滿荊棘。代表性的如Zymeworks 公司的Zanidatamab Zovodotin（ZW49），是一款識別HER2受體雙表位的雙抗ADC，在小鼠模型中顯示出了優(yōu)異的抗腫瘤活性，并且有著不錯的臨床安全性，遺憾的是臨床數(shù)據(jù)不達預(yù)期，Zymeworks正在積極進行改進。而阿斯利康的MEDI4276，則是另一款母單抗與ZW49相同的HER2雙表位ADC藥物，盡管在Ⅰ期臨床中展現(xiàn)了一定療效，卻因嚴(yán)重的毒性問題被終止開發(fā)。
客觀地看，雖然雙抗ADC有更好的療效潛能，但也可能存在治療窗口過窄和毒性疊加的問題。一款成功的ADC藥物，必須把握好療效與安全性之間的平衡。開發(fā)者們在考察藥物療效的同時，需要更多地探究雙抗ADC的作用機制，并盡可能做好安全性評價。
臨床生物分析是藥物作用機制和安全性評價的重要一環(huán)。雙抗ADC藥物的臨床生物分析主要包含藥代動力學(xué)（PK）、抗藥抗體(ADA)以及中和抗體(NAb)分析。
PART 02
雙抗ADC藥物的藥代動力學(xué)分析
雙抗ADC藥物的PK分析具有傳統(tǒng)單抗ADC藥物的特征，比如同樣需要考察復(fù)雜的組分多樣性、DAR值敏感性、靶點干擾和方法一致性，并根據(jù)藥物的作用機制和試劑的可及性統(tǒng)籌設(shè)計。通常情況下，由于雙靶點的存在，雙抗ADC藥物PK分析的試劑可及性要優(yōu)于單抗ADC藥物，甚至不需要抗體，僅用兩個靶點蛋白即可搭建起一套檢測方法。但是另一方面，雙抗ADC藥物也要承受雙靶點帶來的雙份干擾問題，同時抗體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和檢測斷開的抗體的必要性也可能需要考察?？偪贵w和ADC優(yōu)先考慮使用LBA方法檢測而游離小分子毒素優(yōu)先考慮使用LC-MS方法檢測的原則，在雙抗ADC藥物的PK分析中仍適用，但具體采用何種方式檢測哪幾種組分還需具體項目具體分析。
以熙寧|精翰檢測過的某雙抗ADC藥物為例，由于其與天然抗體大小相同、結(jié)構(gòu)相近，無需考慮斷開的抗體，此藥物的PK分析方法與單抗ADC相近，共開發(fā)了3個方法檢測3種形式，分別是LBA的方式檢測總抗體和ADC，LC-MS檢測游離毒素。在總抗體和ADC方法開發(fā)過程中，我們考察了DAR值敏感性（比較了不同試劑對以及不同試劑組合的差異），同時結(jié)合健康人以及受試者體內(nèi)游離靶點蛋白的濃度水平，我們優(yōu)化并考察了靶點干擾水平，最終開發(fā)了適合臨床檢測的生物分析方法。在使用LC-MS檢測游離毒素方面，需要重點考慮ADC、游離毒素的穩(wěn)定性，目前熙寧|精翰在面對不穩(wěn)定ADC和游離毒素時，針對性地設(shè)計了不同的開發(fā)策略，通過定制特殊采血管的方式，在增加樣品穩(wěn)定性的同時，極大簡化臨床操作，提高了臨床操作的依從性。
但阿斯利康的雙抗ADC藥物MEDI4276的PK分析則全部基于LC-MS/MS平臺完成，總共開發(fā)了3個方法檢測5種組分。與常規(guī)ADC藥物一樣，MEDI4276藥物在體內(nèi)也會經(jīng)歷毒素從完整ADC分子上解離的過程。但需額外注意的是，MEDI4276完整分子上的毒素是乙?；男问?，其乙酰化位點在體內(nèi)可能被去乙?；?，且去乙?；亩舅丶瓤梢越Y(jié)合在抗體上形成去乙?；腁DC也可以脫離抗體成為去乙?；挠坞x毒素。相比于ADC藥物PK分析一般檢測總抗體、ADC和游離毒素三項的做法，MEDI4276需額外檢測去乙酰化的ADC和去乙?；挠坞x毒素。具體做法為：方法1. 利用抗藥抗體親和捕獲 + 胰蛋白酶消化 + LC-MS/MS檢測特征性肽段和游離毒素，定量總抗體和ADC；方法2. 利用抗藥抗體親和捕獲 + 胰蛋白酶消化 + LC-MS/MS檢測去乙酰化游離毒素，定量去乙酰化ADC；方法3. 利用蛋白沉淀 + 固相提取 + LC-MS/MS檢測游離毒素和去乙酰化游離毒素。
圖2 雙抗ADC藥物MEDI4276的去乙?；?/span>
圖3 多樣化的LC-MS/MS平臺實現(xiàn)雙抗ADC藥物MEDI4276臨床PK分析
PART 03
雙抗ADC藥物的抗藥抗體分析
ADA樣品分析的流程可分為初篩、確證、滴度和中和抗體分析。首先對樣品進行初篩，初篩陽性的樣品進行確證分析，確證陽性的樣品進行滴度分析和中和抗體分析。鑒于雙抗ADC藥物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，通常會對ADA確證為陽性的樣本進一步開展域特異性分析。推薦至少進行抗體端的域特異性確證，對于抗體端的不同表位、毒素和Linker則基于項目進展以及試劑儲備等實際情況的考慮進行考察。同時，在方法開發(fā)階段還需測試藥物和靶點對陽性對照抗體信號的影響，可通過酸化、固相/磁珠提純、PEG沉淀等方法提高藥物耐受，利用競爭性的抗靶點抗體或靶點受體去除靶點干擾，實踐中可根據(jù)實際情況靈活運用或嘗試各種方式的組合。另外，高比例的ADC標(biāo)記可能會增加ADC標(biāo)記試劑的不穩(wěn)定性，或者掩蓋ADA識別表位，推薦在方法開發(fā)階段進行不同標(biāo)記比的測試和選擇合適的試劑儲存條件。最后，雙抗ADC藥物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性還可能帶來代謝產(chǎn)物的多樣性，而不同的代謝產(chǎn)物也可能成為ADA的來源，因此開發(fā)的方法需盡量滿足對包含主要代謝產(chǎn)物在內(nèi)的藥物ADA的檢測。
以熙寧|精翰內(nèi)部的某雙抗ADC藥物的ADA分析項目為例，此項目選擇的是MSD平臺，靶點干擾是其方法學(xué)面臨的主要考驗。經(jīng)過多輪嘗試，熙寧|精翰選擇了利用抗靶點抗體去除靶點和酸化提高藥物耐受的策略，成功克服了靶點干擾的問題。由于此藥物結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，所以建立方法時并未考察代謝產(chǎn)物的影響。
但阿斯利康的雙抗ADC藥物MEDI4276則相對復(fù)雜一些，由于毒素去乙酰化后可以形成去乙?；腁DC分子和去乙?；挠坞x毒素， MEDI4276的ADA分析考察了不同代謝產(chǎn)物的影響。MEDI4276的ADA檢測采用等量的Biotin標(biāo)記的ADC、去乙?；疉DC和裸抗共同包被作為捕獲試劑，與樣品孵育后，再用等量的Ru標(biāo)記的ADC、去乙酰化ADC和裸抗混合作為檢測試劑進行檢測的方法。此方法可以在一個實驗中完成對MEDI4276及其主要代謝產(chǎn)物抗藥抗體的篩選、確證和滴度試驗，方法靈敏度105.75 ng/mL。藥物耐受方面，在100、1000、10000和100000 ng/mL的MEDI4276藥物存在下，390、6250、25000和100000 ng/mL的陽性對照抗體仍可被檢測到。
PART 04
雙抗ADC藥物的中和抗體分析
對于ADA抗藥抗體陽性的樣本，通常需要進行中和抗體分析。推薦使用細(xì)胞平臺進行雙抗ADC藥物的中和抗體分析，細(xì)胞學(xué)實驗更能反映藥物和中和抗體在體內(nèi)的真實情況，也更符合法規(guī)的要求。細(xì)胞平臺檢測NAb首先要解決的是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，通常可以選用藥物生物學(xué)活性實驗中用到的細(xì)胞，如不可得，則可能需要多方查找篩選或個性化定制開發(fā)，并可能導(dǎo)致項目周期延長。此外，細(xì)胞學(xué)實驗還存在很多困難，例如linker不夠穩(wěn)定導(dǎo)致信號窗口窄、靈敏度過低、酸性條件影響細(xì)胞活性、基質(zhì)或藥物干擾過大等。當(dāng)細(xì)胞平臺因為種種原因無法實現(xiàn)時，也可考慮采用 CLBA 平臺檢測。無論采用細(xì)胞平臺還是CLBA平臺進行NAb分析，都需要中和抗體作為陽性對照，而這正是NAb分析的另一個挑戰(zhàn)。如果陽性抗體的中和活性不是很好，NAb分析方法的開發(fā)就會比較困難，極端情況下甚至可能導(dǎo)致項目無法繼續(xù)推進。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和陽性中和抗體是NAb分析的關(guān)鍵試劑，開發(fā)耗時也較長，建議有檢測需求的各方提前準(zhǔn)備。
雙抗ADC分為單靶點雙表位和雙靶點兩類，這個區(qū)別可能導(dǎo)致NAb分析策略上的差異。如果是單靶點雙表位ADC，其分析策略與單抗ADC相近，通常開發(fā)一個方法即可。如果是雙靶點ADC，則可能需要針對兩個靶點開發(fā)兩個方法單獨分析。此外，開發(fā)同時表達兩個靶點蛋白的一個細(xì)胞系、建立一個方法整體分析也是可以嘗試的方向。
PART 05
結(jié)語
熙寧生物|精翰生物在ADC藥物的檢測上積累了豐富的經(jīng)驗，已開展30+個ADC藥物的40+項臨床試驗，30+個候選分子非臨床服務(wù)，涉及EGFR、Her2、FRα、Trop-2、Nectin-4、MUC18、CD33、CD73、CD19、B7H3等單雙抗靶點和MMAE、MMAF、DM1、SN38、DXD、Duostatin-5等毒素，能夠為廣大藥企提供充分的臨床檢測支持。歡迎感興趣的朋友在后臺留言咨詢。
表2 熙寧生物|精翰生物ADC藥物檢測經(jīng)驗（部分）
參考文獻：
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