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隨著新的分子實(shí)體或者新的治療方式首次進(jìn)入人體，基于安全性考量，CD3 based雙抗/多抗起始給藥劑量較低，而較低的給藥劑量對(duì)雙/多特異抗體基于LBA PK檢測(cè)方法的靈敏度需求提出了挑戰(zhàn)。本文將以已上市的雙特異抗體Blinatumomab (Blincyto)的生物學(xué)分析方法為案例，討論雙/多特異抗體基于結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)性原理；并以熙寧生物丨精翰生物采用的細(xì)胞平臺(tái)高靈敏度的方法學(xué)為案例，提出在劑量爬坡階段可采用Cell-based PK高靈敏分析方法作為解決方案，用于CD3 based雙抗/多抗和mRNA遞送雙抗/多抗的PK分析。

目前在全球獲批的雙特異抗體藥物有多款，Blinatumomab是其中最早之一，用于二線治療費(fèi)城染色體陰性，復(fù)發(fā)或者難治的急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）。Blinatumomab是Amgen公司基于其雙抗平臺(tái)bi-specific T-cell engagers (BiTEs)研發(fā)的雙特異抗體。從結(jié)構(gòu)上分析，Blinatumomab由一個(gè)抗CD19抗體的scFv（單鏈可變區(qū)片段）和一個(gè)抗CD3E抗體的scFv（單鏈可變區(qū)片段）通過(guò)柔性多肽共價(jià)偶聯(lián)組成圖1A, 其具體的氨基酸序列見(jiàn)下圖2。從功能上分析，Blinatumomab能夠同時(shí)結(jié)合ALL細(xì)胞表面的CD19抗原和T細(xì)胞表面的CD3E抗原，從而橋連T細(xì)胞接近ALL細(xì)胞，激活T細(xì)胞殺死ALL細(xì)胞圖2B。

Blinatumomab由兩個(gè)ScFv組成，缺少正?？贵w的Fc端，無(wú)法通過(guò)Fc介導(dǎo)的FcRn內(nèi)吞作用來(lái)延長(zhǎng)半衰期，相對(duì)于常規(guī)抗體長(zhǎng)達(dá)2-3周的消除半衰期，Blinatumomab的消除半衰期非常短，只有1.25 ± 0.63小時(shí)（見(jiàn)表1，患者使用手提式的微型泵和端口系統(tǒng)，以4周為一個(gè)周期進(jìn)行15 μg/m2/d持續(xù)的靜脈注射）。接下來(lái)本文將主要對(duì)Blinatumomab藥代動(dòng)力學(xué)的分析方法進(jìn)行討論。

Blinatumomab的藥代動(dòng)力學(xué)分析方法不同于以配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)為平臺(tái)的傳統(tǒng)生物分析方法，其分析方法是基于其結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)性MOA機(jī)理，以細(xì)胞平臺(tái)為基礎(chǔ)建立起來(lái)。簡(jiǎn)略的過(guò)程如下：

Blinatumomab的細(xì)胞學(xué)生物分析方法是基于其結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)，基于T細(xì)胞的激活需要刺激和共刺激信號(hào)。單純的Raji或者Blinatumomab與T細(xì)胞孵育反應(yīng)，均不能有效的激活T細(xì)胞導(dǎo)致T細(xì)胞細(xì)胞膜表面的CD69上調(diào)。只有采用Blinatumomab的抗CD19 ScFv一端橋接CD19+ Raji細(xì)胞, 抗CD3e ScFv一端刺激T細(xì)胞，才能利用B細(xì)胞共刺激激活T細(xì)胞，利用細(xì)胞膜標(biāo)志物CD69進(jìn)行檢測(cè)。CD69在T細(xì)胞膜上的上調(diào)程度和Blinatumomab的藥物濃度呈劑量依賴關(guān)系，從而起到定量分析的作用，該細(xì)胞學(xué)的生物學(xué)分析方法的定量下限能夠達(dá)到100pg/ml。

熙寧生物|精翰生物自主構(gòu)建了NF-AT報(bào)告基因Jurkat穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系來(lái)替代Blinatumomab生物分析方法中的T細(xì)胞，采用相同的Raji細(xì)胞和Blinatumomab抗體，建立了Blinatumomab的細(xì)胞平臺(tái)的生物分析方法，通過(guò)激活Jurkat細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告基因luciferase的表達(dá)，檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)值，Blinatumomab的劑量和化學(xué)發(fā)光信號(hào)值大小正相關(guān)，該定量方法的檢測(cè)下限能夠達(dá)到6.25pg/mL，LOD可達(dá)3pg/mL, 同時(shí)關(guān)鍵試劑僅需要標(biāo)準(zhǔn)品、現(xiàn)貨靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，無(wú)需制備抗雙抗獨(dú)特性抗體，可快速開(kāi)展，節(jié)約項(xiàng)目準(zhǔn)備周期。具體的數(shù)據(jù)如下圖3：

基于熙寧生物丨精翰生物自主構(gòu)建的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞檢測(cè)體系，高靈敏Cell-based 的PK生物分析方法能夠檢測(cè)到1ug級(jí)別給藥劑量的PK血藥濃度，對(duì)于有較高細(xì)胞因子釋放風(fēng)險(xiǎn)的CD3 based雙抗/多抗來(lái)說(shuō)，是檢測(cè)低至10pg/mL級(jí)別血藥樣品的最佳選擇。目前已在多個(gè)mRNA遞送雙抗/多抗, CD3 based 雙抗/多抗IIT和I臨床項(xiàng)目進(jìn)行應(yīng)用，有成熟方法學(xué)體系。同時(shí)通過(guò)定制靶細(xì)胞系，可實(shí)現(xiàn)TAA是CD19，或者是任意實(shí)體瘤靶點(diǎn)，具備靶點(diǎn)的廣譜適用性。方法學(xué)部分性能如下：

CLD18.2 CD3雙抗 高靈敏度方法學(xué)

CD3 CD19雙抗 方法學(xué)參數(shù)