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數(shù)字PCR通過單個(gè)模板分子的PCR擴(kuò)增，擺脫了擴(kuò)增效率的限制，可實(shí)現(xiàn)不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本的絕對(duì)定量。作為一種準(zhǔn)確、高靈敏度的定量PCR技術(shù)，在醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和食品安全等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
PART 01
數(shù)字PCR介紹
數(shù)字PCR檢測(cè)流程可大致概括為3個(gè)步驟：
Partition 將傳統(tǒng)PCR中的單一體系進(jìn)行稀釋，分散成幾萬個(gè)微滴，分散數(shù)量越多，每個(gè)單元中目標(biāo)分子濃度越高，起始低濃度靶分子的檢測(cè)可能性就越大，檢測(cè)靈敏度就越高。 Amplification 每個(gè)微滴中進(jìn)行獨(dú)立的PCR擴(kuò)增，檢測(cè)靈敏度提高的同時(shí)也能夠有效降低反應(yīng)體系中化合物的干擾。 Analysis 擴(kuò)增結(jié)束后檢測(cè)各個(gè)獨(dú)立反應(yīng)單元的熒光信號(hào)，根據(jù)泊松分布原理進(jìn)行分析，得出待測(cè)靶分子的拷貝數(shù)。
PART 02
基于泊松分布 (Poisson Distribution) 的絕對(duì)定量
數(shù)字PCR的高精確度除了與其前期樣本分散有關(guān)外，另一個(gè)重要的原因就是在數(shù)字PCR檢測(cè)分析中引入了泊松分布原理。
理論上，DNA分子可以平均分配到各獨(dú)立的反應(yīng)單元中，檢測(cè)時(shí)有熒光信號(hào)就可直接判讀為目標(biāo)分子的拷貝數(shù)。但實(shí)際操作中，DNA分子是隨機(jī)分布的，每個(gè)反應(yīng)單元可能包含兩個(gè)或兩個(gè)以上的目標(biāo)分子。
圖1 理想情況下和實(shí)際情況下DNA分子分布對(duì)比
假設(shè)反應(yīng)體系中總的靶基因拷貝數(shù)為m，獨(dú)立的反應(yīng)單元為n，每個(gè)反應(yīng)單元中靶基因拷貝數(shù)：λ=m÷n ， 由于每個(gè)單元中實(shí)際包含的靶基因拷貝數(shù)是離散的（0、1、2……），那么分區(qū)中包含k個(gè)靶基因拷貝數(shù)的概率服從泊松分布：
數(shù)字PCR采用終點(diǎn)法檢測(cè)，即使微滴中只含有1個(gè)靶基因拷貝也能被檢測(cè)到，儀器通過分辨各反應(yīng)單元的陰陽(yáng)性情況，通過陰性反應(yīng)單元的比例和樣品稀釋倍數(shù)（或微滴數(shù)），采用泊松分布的概率公式進(jìn)行計(jì)算，即可獲得樣品的拷貝數(shù)濃度，實(shí)現(xiàn)DNA的精確定量。
PART 03
數(shù)字PCR方法驗(yàn)證
數(shù)字PCR以其更高的準(zhǔn)確度及靈敏度等優(yōu)勢(shì)，在基因和細(xì)胞治療產(chǎn)品的生物分析領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。2020年和2021年的《生物分析白皮書》深入討論了qPCR和dPCR之間的差異。在2021年的專家共識(shí)建議基礎(chǔ)上，2022年的GCC白皮書從CRO的角度出發(fā)，對(duì)dPCR的開發(fā)和驗(yàn)證達(dá)成了更多共識(shí)。目前，數(shù)字PCR平臺(tái)建議的驗(yàn)證項(xiàng)包括精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、選擇性、定量下限和穩(wěn)定性等關(guān)鍵指標(biāo)。
微滴數(shù)量（對(duì)于微滴式數(shù)字PCR）
根據(jù)使用儀器的不同，實(shí)驗(yàn)可生成的微滴數(shù)量也各有差別，微滴數(shù)量過低不適用于泊松分布，檢測(cè)結(jié)果可信度也將變低，方法驗(yàn)證中應(yīng)設(shè)定合適的接受標(biāo)準(zhǔn)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線
區(qū)別于qPCR檢測(cè)，數(shù)字PCR僅在驗(yàn)證階段需要在分析批中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度、精密度及線性范圍；樣品分析中，數(shù)字PCR無需標(biāo)準(zhǔn)曲線參與計(jì)算即可得出待測(cè)樣品的拷貝數(shù)結(jié)果。
對(duì)于濃度≥50 copies/20 μL反應(yīng)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)，接受標(biāo)準(zhǔn)為%RE在±35 %以內(nèi)，%CV ≤40%；對(duì)于濃度＜50 copies/20 μL反應(yīng)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)，接受標(biāo)準(zhǔn)為%RE在±50 %以內(nèi)，%CV ≤80%。
陽(yáng)性對(duì)照
分析批中使用陽(yáng)性對(duì)照（包含目的基因片段的質(zhì)?；騺碜躁?yáng)性細(xì)胞的基因組DNA等）來監(jiān)控方法的穩(wěn)定性。
定量下限
關(guān)于dPCR的定量下限（LLOQ），GCC白皮書（2021年）和2022年《生物分析白皮書》中之前關(guān)于50 copies /μg DNA的建議仍然適用，LLOQ的測(cè)定同時(shí)也應(yīng)考慮儀器的理論%CV和背景gDNA量，以力求達(dá)到白皮書推薦的50拷貝/μg DNA靈敏度。
熒光校正
進(jìn)行多通道檢測(cè)時(shí)，各熒光通道之間可能會(huì)產(chǎn)生熒光串?dāng)_，此時(shí)可通過熒光校正實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)中包含negative control和單色陽(yáng)性control）進(jìn)行調(diào)節(jié)。
PART 04
數(shù)字PCR技術(shù)優(yōu)勢(shì)和展望
數(shù)字PCR技術(shù)在既往的研究中凸顯出諸多優(yōu)勢(shì)：
? 反應(yīng)和結(jié)果判讀受擴(kuò)增效率影響大大降低； ? 對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高； ? 數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過程可以極大程度上降低與目標(biāo)序列有競(jìng)爭(zhēng)性作用的背景序列濃度，適用于在復(fù)雜背景中檢測(cè)稀有突變； ? 與傳統(tǒng)熒光定量PCR相比，有更加出色的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，在極微量核酸樣本檢測(cè)、表達(dá)量微小差異鑒定、拷貝數(shù)變異檢測(cè)等方面的應(yīng)用已被廣泛認(rèn)可。
隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，數(shù)字PCR系統(tǒng)正變得越來越靈活，性能在不斷提高，多重檢測(cè)與分析得到改善，相信數(shù)字PCR系統(tǒng)將很快進(jìn)入臨床診斷的應(yīng)用，為生物研究提供更精準(zhǔn)可靠得核酸分子檢測(cè)與定量分析。
PART 05
熙寧生物|精翰生物PCR平臺(tái)服務(wù)方案
熙寧生物|精翰生物基因檢測(cè)平臺(tái)配備了法國(guó)Stilla Technologies公司NaicaTM crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)（Nicia Geode微滴生成/擴(kuò)增系統(tǒng)&Nicia Prism3微滴讀取與分析系統(tǒng)），3色檢測(cè)系統(tǒng)，兼容多重檢測(cè)性能，靈敏度能夠達(dá)到2拷貝每反應(yīng)，可以從方法開發(fā)，方法驗(yàn)證，以及樣本檢測(cè)等方面提供一站式全方位的支持。
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