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PART 01
諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎microRNA
2024年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎授予科學(xué)家維克托·安布羅斯（Victor Ambros）和加里·魯夫昆（Gary Ruvkun），以表彰他們發(fā)現(xiàn)了微小RNA（microRNA）及其在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用。這不僅是對microRNA在生物學(xué)基礎(chǔ)研究中的重要性的認(rèn)可，更為藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用帶來了新的機(jī)遇。
圖1 遺傳信息從DNA到mRNA再到蛋白質(zhì)的流動
要理解這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)的重要性，我們需要先了解生物體內(nèi)基因表達(dá)的基本過程。RNA作為中心法則的重要組成部分，起著承上啟下的作用。它不僅是遺傳信息傳遞的橋梁，也是基因表達(dá)調(diào)控的重要參與者。在細(xì)胞內(nèi)，RNA負(fù)責(zé)將存儲在DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)錄為可用于合成蛋白質(zhì)的信使RNA，并通過翻譯轉(zhuǎn)化為具有生物功能的蛋白質(zhì)。這一過程使得細(xì)胞能夠精確地響應(yīng)內(nèi)外部環(huán)境的變化，從而保持生命活動的正常進(jìn)行。
microRNA是一類很短的RNA分子，通常只有20~24個核苷酸長。這些微小分子不產(chǎn)生蛋白質(zhì)，而是通過影響其他 RNA分子來調(diào)節(jié)基因的活動。上世紀(jì)80年代，Ambros和 Ruvkun在研究線蟲生長相關(guān)的生理學(xué)機(jī)制時，偶然發(fā)現(xiàn)lin-4 基因產(chǎn)生的一小段microRNA，就像一個微型密碼，而這個密碼恰好能部分匹配lin-14基因末端的一些重復(fù)片段，當(dāng)兩個分子相結(jié)合，就會阻止lin-14產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
然而，這個發(fā)現(xiàn)一開始并沒有引起太多關(guān)注。直到2000 年，Ruvkun 的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了名為let-7的第二個microRNA。let-7不僅存在于線蟲中，還在人類和其他動物中被發(fā)現(xiàn)，這意味著microRNA調(diào)控機(jī)制在動植物界具有普遍性，由此引起了科研界的深度重視與廣泛研究。
PART 02
RNA的分類及功能
隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，RNA的研究也不斷深化。高通量測序技術(shù)的發(fā)展使得研究人員能夠全面分析細(xì)胞內(nèi)的RNA組成，揭示不同細(xì)胞類型和狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組特征。RNA根據(jù)是否編碼蛋白質(zhì)可以分為編碼RNA（coding RNA）與非編碼RNA（non-coding RNA）。
編碼RNA（coding RNA）
編碼RNA即我們常知的mRNA，負(fù)責(zé)將DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)。mRNA在細(xì)胞核中合成后，經(jīng)過一系列的加工和修飾（如加上5'帽和3'聚腺苷酸尾）后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，供翻譯使用。
mRNA轉(zhuǎn)錄組測序通過比較不同組織類型、發(fā)育階段或處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄組，揭示基因表達(dá)的動態(tài)變化。分析基因的表達(dá)水平可以揭示疾病相關(guān)的基因表達(dá)變化，幫助藥企與研究人員深入理解疾病機(jī)制，優(yōu)化藥物療效和安全性。
非編碼RNA（non-coding RNA）
非編碼RNA（non-coding RNA）通過多種機(jī)制互相作用，共同調(diào)控基因表達(dá)的各個階段。它們不僅影響轉(zhuǎn)錄后過程，還參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、代謝調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期等重要生物過程。
除tRNA與rRNA外，其他非編碼RNA如微小RNA（microRNA）可以通過結(jié)合到目標(biāo)mRNA上，抑制其翻譯或?qū)е缕浣到?，從而調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)水平；長鏈非編碼RNA （lncRNA）則通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和其他細(xì)胞過程；環(huán)狀RNA （circle RNA）以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在，通常由內(nèi)含子剪接產(chǎn)生，吸附并抑制特定microRNA的功能，從而調(diào)節(jié)microRNA靶基因的表達(dá)；小干擾RNA （siRNA）是一類雙鏈小RNA，參與RNA干擾（RNAi）機(jī)制，通過降解特定mRNA來沉默基因表達(dá)；小核RNA（snRNA）主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，參與mRNA前體的剪接及其他RNA加工過程；小核仁RNA（snoRNA）主要位于核仁中，參與rRNA的化學(xué)修飾和加工等等。這些非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了中心法則的內(nèi)涵，還為理解基因調(diào)控的復(fù)雜性提供了新視角。
非編碼RNA轉(zhuǎn)錄組測序正日益成為推動藥物研發(fā)和精準(zhǔn)醫(yī)療的重要工具。通過非編碼RNA轉(zhuǎn)錄組測序，藥企能夠識別與特定疾病相關(guān)的非編碼RNA，從而發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)；由于非編碼RNA在體液中（如血液和尿液）相對穩(wěn)定，其表達(dá)水平也可以用于早期診斷和疾病預(yù)后評估；通過對特定非編碼RNA的功能研究，能夠揭示其在疾病發(fā)生過程中的作用，不僅有助于深入理解疾病的分子機(jī)制，還可以為開發(fā)新型治療策略提供理論依據(jù)；例如，lncRNA通過調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄或參與染色質(zhì)重塑，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程。通過監(jiān)測特定非編碼RNA的表達(dá)變化，研究人員能夠判斷藥物是否有效，并識別潛在的副作用。這種實(shí)時的監(jiān)測手段有助于優(yōu)化治療方案，最大限度地提高藥物的療效和安全性。
PART 03
實(shí)驗(yàn)端檢測：RNA-Seq建庫流程
圖２ 熙寧|精翰轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒?yàn)技術(shù)路線
以mRNA建庫為例，總RNA抽提后需要測定濃度和純度，同時由于RNA容易降解，需要通過電泳測定RNA的完整度。
總RNA中含有大量的核糖體 RNA (rRNA)，約占總RNA 80-98%。對絕大多數(shù) RNA-Seq 應(yīng)用來說，需要去除 rRNA 或捕獲mRNA，從而保證測序數(shù)據(jù)集中在轉(zhuǎn)錄組所需的部分并節(jié)省成本。mRNA的富集通常有兩種方式，Poly(A)捕獲使用Oligo(dT) 分子雜交mRNA的Poly(A)尾從而實(shí)現(xiàn)mRNA的富集。poly(A) 富集需要高質(zhì)量的 RNA，如果是放置時間長的組織樣本，RNA可能降解斷裂，同時由于對 poly(A) 尾的選擇，3' 端被富集，而5' 序列容易丟失，因此Poly(A)捕獲常存在捕獲效率低和偏好性的問題。
熙寧生物｜精翰生物采用rRNA去除的方法，rRNA去除原理是通過互補(bǔ)DNA寡核苷酸雜交和RNA酶H消化，去除與DNA寡核苷酸雙鏈化的rRNA和珠蛋白mRNA（mRNA中珠蛋白mRNA約占30%-70%），然后進(jìn)行DNA酶處理以清除DNA寡核苷酸。rRNA去除的方法效率更高，可以保留更豐富的mRNA分子。
隨后經(jīng)過片段化和逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，再經(jīng)過加A和接頭連接，以及擴(kuò)增和純化，即完成建庫。由于DNA的兩條鏈均可以作為模板轉(zhuǎn)錄mRNA，如果無法區(qū)分模板的來源則會發(fā)生干擾。熙寧生物｜精翰生物采用鏈特異性建庫，保留了轉(zhuǎn)錄本的方向信息，可區(qū)分轉(zhuǎn)錄本的來源，避免了互補(bǔ)鏈的干擾。
PART 04
生信端分析：轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析
圖３ 熙寧|精翰轉(zhuǎn)錄組測序生信分析流程
熙寧生物｜精翰生物的轉(zhuǎn)錄組測序生信分析流程包括多個關(guān)鍵步驟，以確保數(shù)據(jù)的高質(zhì)量和準(zhǔn)確性。首先，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，涵蓋數(shù)據(jù)拆分、測序元件序列去除、質(zhì)量控制和過濾，以及質(zhì)量指標(biāo)統(tǒng)計(jì)。經(jīng)過質(zhì)控的數(shù)據(jù)將被比對至參考基因組，統(tǒng)計(jì)比對率和測序深度等指標(biāo)。根據(jù)基因組特征，統(tǒng)計(jì)每個基因的表達(dá)豐度（RC，Ｒead Ｃount）并進(jìn)行基因注釋，可視化基因的表達(dá)水平，進(jìn)行樣本相關(guān)性分析及主成分分析，并針對有重復(fù)樣本和任意分組的無重復(fù)樣本進(jìn)行差異基因分析與差異基因功能富集分析。轉(zhuǎn)錄組測序的高級分析包括蛋白網(wǎng)絡(luò)分析、基因集差異分析、基因集富集分析、免疫浸潤分析等。合并統(tǒng)計(jì)多個樣本的質(zhì)控信息進(jìn)行綜合分析和展示。通過這一系統(tǒng)流程，為客戶提供全面而深入的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析服務(wù)。
部分結(jié)果展示：
圖４ 熙寧|精翰轉(zhuǎn)錄組測序生信分析結(jié)果部分展示
PART 05
熙寧｜精翰生物RNA-Seq檢測服務(wù)
在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)的前沿，熙寧生物｜精翰生物轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)已完成分析性能驗(yàn)證，可全面分析組織、血液、石蠟包埋切片等樣本的mRNA表達(dá)情況，采用Roche KAPA試劑進(jìn)行rRNA去除和鏈特異性文庫構(gòu)建，保證文庫質(zhì)量和數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，使用Illumina測序儀完成上機(jī)測序。生信流程覆蓋基因差異表達(dá)分析、差異基因功能和通路注釋等，最終出具完整全面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果報告，可在5~8個工作日內(nèi)完成樣本分析全流程，助力申辦方開展藥物作用機(jī)制研究和生物標(biāo)志物研究。
