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熙寧小課-第166期 | 流式細(xì)胞術(shù)在SLE治療藥物研發(fā)中的應(yīng)用
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時間:2025-01-10


PART 01

流式細(xì)胞術(shù)簡介



流式細(xì)胞術(shù)在生物學(xué)及醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,其以流式細(xì)胞儀為技術(shù)支撐,細(xì)胞或其他微粒與相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)蛋白或抗體結(jié)合,在特定波長的發(fā)射光源激發(fā)下,熒光素會發(fā)射出特定波長的光譜,這些光譜能夠被信號接收器接收,通過光電轉(zhuǎn)換器,將熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號,從而呈現(xiàn)在軟件界面。


圖1 流式細(xì)胞儀工作原理示意圖及物理參數(shù)、熒光參數(shù)下分群效果示意圖


流式細(xì)胞術(shù)在藥物研發(fā)與治療、臨床診斷中應(yīng)用:

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細(xì)胞治療:藥代/藥效動力學(xué)檢測,了解細(xì)胞治療藥物體內(nèi)擴(kuò)增及代謝情況,了解靶細(xì)胞殺傷及重建情況,且通過分析給藥前后記憶、效應(yīng)、活化、耗竭細(xì)胞表達(dá)情況,進(jìn)一步闡釋藥物作用機(jī)理及監(jiān)控藥效;

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藥物研發(fā)和篩選:受體占位,補(bǔ)體沉積,體外毒性研究等;

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表觀遺傳學(xué)應(yīng)用:蛋白翻譯后修飾(如甲基化、乙?;⒘姿峄龋?,細(xì)胞通訊,鈉氫轉(zhuǎn)運(yùn)體活性,脂筏結(jié)合蛋白等;

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免疫系統(tǒng)評估:免疫分型,功能亞群評估等;

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血液疾病診斷和治療:微小殘留病,血小板,網(wǎng)織紅細(xì)胞,陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿等

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疾病診斷:CD64在感染性疾病診斷中應(yīng)用廣泛,HLA-B27與多種疾病高度相關(guān);

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腫瘤學(xué)方向:細(xì)胞周期、凋亡、壞死、DNA倍體分析等;

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移植:組織交叉配型,HLA特異性抗體篩查,CD34+絕對計數(shù)等。



圖2 流式細(xì)胞術(shù)在藥物研發(fā)與治療、臨床診斷中的應(yīng)用


流式細(xì)胞術(shù)在自身免疫性疾病中應(yīng)用:


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自身免疫性疾病是由于免疫系統(tǒng)異常激活,產(chǎn)生針對自身組織和細(xì)胞的抗體或免疫細(xì)胞,導(dǎo)致組織損傷和器官功能障礙的一類疾病。常見的自身免疫性疾病有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、免疫性血小板減少癥(ITP)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、干燥綜合征(SjD)、強(qiáng)直性脊柱炎(AS)、多發(fā)性硬化癥(MS)、腎小球腎炎(GN)等。

?  

流式細(xì)胞術(shù)通過檢測免疫細(xì)胞數(shù)量、比例和功能狀態(tài),從而對患者的免疫系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測,評估治療的有效性和持續(xù)性,指導(dǎo)治療方案的制定和調(diào)整。



  

如在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中,常常會出現(xiàn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的失衡;在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中,T細(xì)胞的活化和炎癥因子的分泌增加;強(qiáng)直性脊柱炎特征是先天和先天樣免疫細(xì)胞的異常活動……

  

如“B細(xì)胞指導(dǎo)方案”用于利妥昔單抗(RTX)治療后復(fù)發(fā)或維持治療: 通過監(jiān)測外周血CD20+/CD19+ B細(xì)胞數(shù)量,在B細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)(CD19+ B細(xì)胞≥5個/mm3)時,追加RTX劑量,對患者維持治療、減少復(fù)發(fā)時有效。參考《利妥昔單抗在腎小球腎炎中應(yīng)用的專家共識》。



PART 02

SLE臨床治療及潛在治療靶點(diǎn)


SLE是自身免疫介導(dǎo)的、以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病,該病以血清中出現(xiàn)抗核抗體為代表的多種自身抗體及多系統(tǒng)、多器官受累為主要特征,具有極高的異質(zhì)性,臨床表現(xiàn)多樣,預(yù)后差異較大。

臨床上治療SLE的常用藥物包括糖皮質(zhì)激素(簡稱激素)、免疫抑制劑、丙種球蛋白和生物制劑。生物制劑包括利妥昔單抗(抗CD20的嵌合人/鼠單克隆抗體,能清除B細(xì)胞,使多數(shù)患者出現(xiàn)至少持續(xù)4-12月的外周血B淋巴細(xì)胞減少)、貝利單抗(B淋巴細(xì)胞刺激因子(BLyS)的抑制劑,是一種重組的完全人源化IgG2λ單克隆抗體,可與可溶性BLyS高親和力結(jié)合并抑制其活性)。



圖3 SLE潛在治療靶點(diǎn)的分子途徑示意圖

注:以上內(nèi)容主要參考《風(fēng)濕免疫疾病超藥品說明書用藥專家共識(之二)——系統(tǒng)性紅斑狼瘡》


PART 03

流式細(xì)胞術(shù)在SLE治療藥物研發(fā)中的應(yīng)用


經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心披露臨床試驗(yàn)?zāi)驹S可用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡及相關(guān)適應(yīng)癥有159條(檢索截止日期:2024-11-28),涉及77個產(chǎn)品,產(chǎn)品類別涵蓋細(xì)胞治療產(chǎn)品、抗體藥物、小分子抑制劑、受體調(diào)節(jié)劑等。

流式細(xì)胞術(shù)在SLE治療藥物研發(fā)中應(yīng)用廣泛,涵蓋細(xì)胞治療產(chǎn)品的藥代/藥效動力學(xué)監(jiān)測、抗體類藥物的受體占位研究及細(xì)胞免疫分型等研究。本文重點(diǎn)介紹SLE相關(guān)細(xì)胞功能亞群分析。


B淋巴細(xì)胞功能亞群分析:


SLE特征為自身抗體的產(chǎn)生和B淋巴細(xì)胞功能的異常,靶向B細(xì)胞治療的產(chǎn)品,通過分析B細(xì)胞功能亞群,可了解在治療前、后,患者中B細(xì)胞分化情況,并了解炎癥微環(huán)境中B細(xì)胞分化特征,為治療SLE的臨床作用機(jī)理提供相關(guān)支持。

下圖簡單概述B細(xì)胞的主要亞型、發(fā)育及相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)情況:



圖4 B細(xì)胞的主要亞型、發(fā)育示意圖

圖片參考:Challenges and Opportunities for Consistent Classification of Human B Cell and Plasma Cell Populations. Front. Immunol. 10:2458.


圖5 B細(xì)胞的主要亞型、發(fā)育及相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)情況示意圖

圖片來自ThermoFisher官網(wǎng):B 細(xì)胞概述



T淋巴細(xì)胞功能亞群分析:


SLE是由于過度活躍的免疫系統(tǒng)對外來刺激的反應(yīng)過于激進(jìn),導(dǎo)致產(chǎn)生抗核抗體的B細(xì)胞和抗體反應(yīng)增強(qiáng)的T細(xì)胞處于過度興奮狀態(tài)。靶向T細(xì)胞治療及T細(xì)胞功能亞群評估對SLE臨床檢測有重要意義。


表1 目前正在研究或開發(fā)用于SLE治療的T細(xì)胞通路靶向藥物匯總表

圖片參考:T Cells in Systemic Lupus Erythematosus, Rheum Dis Clin North Am. 2021 August ; 47(3): 379–393. doi:10.1016/j.rdc.2021.04.005.


PART 04

熙寧生物|精翰生物流式平臺在SLE治療中相關(guān)檢測經(jīng)驗(yàn)



B淋巴細(xì)胞功能亞群分析:


B細(xì)胞功能亞群分析在靶向B細(xì)胞的細(xì)胞治療產(chǎn)品、抗體類藥物中應(yīng)用廣泛,基于文獻(xiàn)中亞群指標(biāo)有一定差異,熙寧|精翰基于文獻(xiàn)調(diào)研[1]、[2]、[3][4]、[5][6]及早期探索,開發(fā)測試panel可供參考:


  

指標(biāo):CD45,CD19,CD20,CD21,CD27,IgD,CD11c,CD38;

   

亞群: Naive/Memory/Switched memory/DN2/Plasma/Age-associated B/Active na?ve;

   

熙寧|精翰有SLE基質(zhì)采購?fù)緩?,可快速啟動方法學(xué)。



圖6 B細(xì)胞分型-技術(shù)路線



圖7 設(shè)門策略示意圖






圖8 分群效果示意圖


表2 方法學(xué)測試數(shù)據(jù)(特殊采血管1)


備注:測試使用SLE基質(zhì),穩(wěn)定性可達(dá)96h,規(guī)格3mL/9mL


表3 方法學(xué)測試數(shù)據(jù)(特殊采血管2)


備注:測試使用SLE基質(zhì),穩(wěn)定性72h,規(guī)格5mL(含檢測及備份)


表4 樣品采集及運(yùn)輸




熙寧|精翰測試方法,B細(xì)胞功能亞群穩(wěn)定性可達(dá)96h,適合多中心研究,且中心處理簡單便捷,結(jié)果一致性較佳。



T淋巴細(xì)胞功能亞群分析:


熙寧|精翰已有多個T細(xì)胞功能亞群檢測經(jīng)驗(yàn),panel信息供參考:


●  

檢測L/D、CD45、 CD3、CD4、CD8a、CD62L、PD1、TIM3、CCR7、CD137、CD39、CD45RA、TIGIT、BTLA、CD28、CD27、CD69;

●  

檢測L/D、CD45、CD3、CD4、CD8、CD62L、PD1、TIM3、CCR7、LAG3、CD25、CD45RA、CD27、CD69;

●  

檢測組1-CD80、CD86、PD-L1、CD289、CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56、CD33、CD11b、HLA-DR、CD15、CD141、CD123;組2-CD3、CD4、CD8、CD25、Ki67、Foxp3、CD45RA、CCR7、PD-1、ICOS;

●  

檢測組1- L/D、CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RO、CCR7、CD62L、CD27、CD28、CD69、4-1BB、CD39、CD103、HLA-DR、PD1、TIM3、CD57、CX3CR1;組2- L/D、CD45、CD3、CD4、CD8、PD1、LAG3、TIM3、CD244、CTLA-4、Tigit、CXCR5、CD57、KLRG1、CD56、CD16、CD314、CD226、CD9、CD49a、CD159a、CD335;

●  

CD3、CD4、CD8、HLA-DR、CD45、CD152、CD279、CD197、CD45RA、CD38;

●  

CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RA、CD197(CCR7)、CD45RO、CD366(Tim-3)、CD279(PD-1)、CD223(LAG-3)、TCR β。



圖9 凍存全血T細(xì)胞分型-技術(shù)路線(示例)


表5 凍存全血樣品采集&運(yùn)輸



熙寧|精翰自主開發(fā)的全血凍存方案可用于細(xì)胞亞群分析,樣品可實(shí)現(xiàn)凍存批量運(yùn)輸及檢測,相比傳統(tǒng)新鮮檢測模式,可顯著降低運(yùn)輸、檢測成本,整體運(yùn)營成本可降低約2/3;操作簡便,無需特殊儀器設(shè)備和耗材,對臨床中心要求很低。流式平臺配備光譜Cytek NL-CLC(3 激光,38通道),可實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)同時分析,節(jié)省樣品量的同時減少分管檢測消耗的抗體、耗材等費(fèi)用,目前已有20+項(xiàng)目在光譜平臺上穩(wěn)定運(yùn)行。


PART 05

熙寧生物|精翰生物流式平臺可支持業(yè)務(wù)及相關(guān)檢測經(jīng)驗(yàn)


熙寧|精翰流式細(xì)胞團(tuán)隊(duì)由30余名經(jīng)驗(yàn)豐富的人員組成,配備BD流式細(xì)胞儀、Beckman流式細(xì)胞儀、Cytek光譜流式細(xì)胞儀等儀器和設(shè)備,支持過包括抗體類藥物、基因與細(xì)胞治療藥物、小分子創(chuàng)新藥等各類新藥的流式分析檢測,其中抗體藥物>40個,基因與細(xì)胞治療藥物>50 個,小分子創(chuàng)新藥>20 個,臨床試驗(yàn)>100 個,更是支持國內(nèi)第一款I(lǐng) 類新藥的CAR-T產(chǎn)品- 藥明巨諾倍諾達(dá)?(瑞基奧侖賽注射液)的樣本檢測分析工作。平臺能夠支持包括免疫細(xì)胞亞群分型檢測,細(xì)胞治療產(chǎn)品的PK/PD 分析,抗體藥物的受體占位分析,PD指標(biāo)蛋白磷酸化、甲基化、乙酰化檢測,胞內(nèi)因子檢測等。尤其在血液腫瘤淋巴細(xì)胞亞群檢測中具有大量的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn),歡迎咨詢溝通。


參考文獻(xiàn):

[1] C.Wei, J. Anolik., et al., A New Population of Cells Lacking Expression of CD27 Represents a Notable Component of the B Cell Memory Compartment in Systemic Lupus Erythematosus, J Immunol 2007; 178:6624-6633, doi: 10.4049/jimmunol.178.10.6624.

[2]  D. Ramsk?ld, I. Parodis, T. Lakshmikanth, et al., B cell alterations during BAFF inhibition with belimumab in SLE, EBioMedicine, https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2018.12.035.

[3]  Scott A. Jenks, Kevin S. Cashman, et al., Extrafollicular responses in humans and SLE, Immunol Rev. 2019 March; 288(1): 136–148. doi:10.1111/imr.12741.

[4]  Scott A. Jenks, Kevin S. Cashman, et al., Distinct effector B-cells induced by unregulated Toll-like receptor 7 contribute to pathogenic responses in Systemic Lupus Erythematosus, Immunity. 2018 October 16; 49(4): 725–739.e6.

[5]  L.Yuzi, L.zhanguo., et al., Double-negative (DN) B cells: an under-recognized effector memory B cell subset in autoimmunity, Clin Exp Immunol. 2021;205:119–127.

[6] Belouski SS, Wallace D, Weisman M, Ishimori M, Hendricks L, Zack D, Vincent M, Rasmussen E, Ferbas J, Chung J. Sample stability and variability of B-Cell subsets in blood from healthy subjects and patients with systemic lupus erythematosus. Cytometry Part B 2010; 78B: 49–58.




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