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前言
隨著國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心正式發(fā)布《以臨床價值為導(dǎo)向的抗腫瘤藥物臨床研發(fā)指導(dǎo)原則》，中國的新藥研發(fā)邁入深水區(qū)。當(dāng)以患者為核心的臨床藥物研發(fā)開展新藥臨床試驗設(shè)計時，對照組由普遍安慰劑變成了廣泛應(yīng)用的最佳治療方式/藥物，創(chuàng)新藥臨床研發(fā)和獲批的規(guī)則正在被深刻的改變，同時新藥物獲批難度將會進(jìn)一步增大。臨床試驗階段，新藥是否有效？將會被新藥是否比現(xiàn)有療法/同類藥物更加有效這個問題所替代。臨床試驗檢測過程中越早對有效性的問題進(jìn)行回答，在現(xiàn)有的政策環(huán)境下越能夠加快臨床的進(jìn)度，或者及時規(guī)避風(fēng)險。使用Ex vivo試驗用于早期臨床特別是一期臨床的藥效學(xué)評估，是新藥特別是First in class新藥常用的評估方式。筆者將從檢測原理，案例分析和熙寧生物的臨床檢測實踐三方面對Ex Vivo試驗用于早期臨床的藥效學(xué)評估進(jìn)行論述。
Ex Vivo試驗用于臨床檢測原理
有別于In-vitro（體外試驗）使用的活性蛋白或者腫瘤細(xì)胞系，In-vivo（體內(nèi)試驗）使用動物或者人體，Ex-vivo（離體試驗）使用的從動物/人體取出的原代細(xì)胞/組織，采用體外試驗的模式進(jìn)行檢測分析。
臨床Ex-vivo試驗?zāi)Ｊ接捎谄涫褂玫牟牧蟻碜杂谟盟幒蟮娜梭w，該檢測方法相對于in-vitro試驗來說，能夠較為真實的還原藥物在人體復(fù)雜免疫細(xì)胞互作環(huán)境下的真實表現(xiàn)，更具備生理相關(guān)性。同時，臨床Ex-vivo試驗使用體外檢測的模式，相對于in-Vivo試驗，試驗周期較短，能夠更為快捷得到有參考價值的數(shù)據(jù)，特別是在臨床一期健康受試者的臨床試驗中，基于藥物的作用機(jī)理，通過設(shè)計合適的Ex-vivo評價方案，可以獲得跟藥物作用機(jī)理緊密相關(guān)的藥效學(xué)數(shù)據(jù)。
臨床Ex-vivo試驗多采用能夠通過較為簡單方式從人體獲得的生物材料，通常為人全血，人PBMC或者人血清。使用人體的生物材料進(jìn)行檢測，樣品具備多重屬性，既包含有藥物成分，也作為檢測體系中重要構(gòu)成材料，且存在個體差異，不同采樣點(diǎn)的狀態(tài)差異等，臨床Ex-vivo試驗的樣品采集條件控制，檢測條件控制，數(shù)據(jù)處理和解讀均較為復(fù)雜，是難度和變異系數(shù)最高的檢測實驗類型。
無論是小分子藥物，抗體類藥物，免疫調(diào)節(jié)劑類藥物，疫苗類藥物均可通過使用人全血中特定的細(xì)胞亞群或者組分，直接進(jìn)行或者作為替代標(biāo)志物進(jìn)行藥效學(xué)評估。
Ex Vivo試驗臨床早期進(jìn)行藥效學(xué)檢測案例分析
隨著中國新藥研發(fā)進(jìn)一步加速，藥物研發(fā)模式完成了由藥物仿制到靶點(diǎn)追蹤模式的轉(zhuǎn)變，隨著監(jiān)管政策的進(jìn)一步收緊，藥物研發(fā)模式必將進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。筆者認(rèn)為后續(xù)新藥研發(fā)模式進(jìn)一步優(yōu)化，其中一個重要環(huán)節(jié)在于臨床藥物評價體系的構(gòu)建，使用Ex Vivo試驗臨床早期進(jìn)行藥效學(xué)檢測評估將會使臨床藥物評價體系中重要一環(huán)，下面筆者通過公開的資料梳理下Ex Vivo試驗用于早期藥效學(xué)評估的案例。
案例1：抗體藥物Zolbetuximab（anti-Claudin18.2）和cetuximab (anti-EGFR)的Ex vivo ADCC和CDC功能。
抗體藥物通過靶向腫瘤的靶點(diǎn)，介導(dǎo)機(jī)體免疫細(xì)胞和補(bǔ)體殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮ADCC和CDC功能是靶向抗體藥物的主要的藥效學(xué)作用機(jī)理，在1期臨床中進(jìn)行Ex vivo ADCC和CDC功能學(xué)評估是預(yù)測在個體中藥物是否能夠起效的一個關(guān)鍵指標(biāo)。使用細(xì)胞殺傷模型檢測人樣品中IMAB362藥物介導(dǎo)人樣品PBMC介導(dǎo)的殺傷NUGC4的效果，報告基因方法進(jìn)行檢測。
案例2：CD28免疫激動劑Davoceticept (ALPN-202)的Ex vivo臨床藥效學(xué)評估
使用全血共刺激模型檢測人樣品中CD28激動劑Davoceticept藥物介導(dǎo)全血刺激后IL2的分泌，ELISA方法進(jìn)行檢測。
案例3：C3補(bǔ)體抑制劑Empaveli的Ex vivo臨床藥效學(xué)評估
使用補(bǔ)體旁路活化途徑溶血模型檢測人樣品中Empaveli藥物介導(dǎo)的人樣品中血清的溶血效果。
案例4：CDK4/6抑制劑Trilaciclib的Ex vivo臨床藥效學(xué)評估
使用全血刺激模型檢測人樣品中Trilaciclib介導(dǎo)的對人樣品中全血T細(xì)胞的增殖抑制效果,流式方法進(jìn)行檢測。
案例5：RSV抗體Nirsevimab的Ex vivo臨床藥效學(xué)評估
使用RSV病毒感染模型檢測人血清樣品中Nirsevimab對RSV感染細(xì)胞的抑制中和效果，細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行檢測。
案例6：COVID-19 vaccine BNT162b1的Ex vivo臨床藥效學(xué)評估
使用COVID-19 Spike蛋白刺激PBMC模型檢測Spike蛋白RBD多肽Pool刺激人樣品中CD4+和CD8+ T細(xì)胞，檢測人樣品細(xì)胞免疫效果，ELISPOT方法進(jìn)行檢測。
案例7：IL-4Ra 抑制劑 AZD1402的Ex vivo臨床藥效學(xué)評估
使用全血刺激模型檢測人樣品中AZD1402介導(dǎo)的對人樣品中全血CD3細(xì)胞的STAT6磷酸化水平抑制效果,流式方法進(jìn)行檢測。
熙寧生物Ex Vivo試驗實踐和難點(diǎn)考量
熙寧生物有非常豐富的小分子藥物和生物制品早期臨床的藥效學(xué)評估經(jīng)驗，相對于傳統(tǒng)的PK藥物代謝，定量型biomarker或者免疫原性分析方法，Ex Vivo藥效學(xué)試驗有包含全部或者部分顯著性區(qū)別和難點(diǎn)：
1.非定量型檢測。藥效學(xué)檢測的是藥物引起體內(nèi)生物材料的變化如PBMC的轉(zhuǎn)錄因子蛋白磷酸化水平變化，該變化指向的目的分子往往沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，無法在檢測體系中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品檢測無法匯報具體的濃度結(jié)果。該情況引發(fā)的后果是需要通過檢測方法得到信號值變化或者均一化以后的信號值變化來對藥物引起的變化進(jìn)行表征，而在長期的樣品分析過程中，信號值變化除了會受到藥物的影響，同時也會受到不同天檢測方法條件的影響，為多變量參數(shù)。因此，在進(jìn)行Ex Vivo藥效學(xué)試驗時，維持不同天檢測方法條件的嚴(yán)格一致性，是臨床藥效學(xué)試驗取得跟藥物有相關(guān)性結(jié)果的關(guān)鍵。
2.個體差異。Ex Vivo藥效學(xué)試驗檢測結(jié)果除了受藥物影響外，會受到來自于個體的生物材料的顯著影響，通常生物材料具備顯著的個體差異（如不同個體的PBMC在檢測體系中有不同的響應(yīng)強(qiáng)度）。該情況引發(fā)的后果是需要通過檢測單個個體的Pre-dose樣品和用藥后樣品進(jìn)行藥效學(xué)比較，可能會出現(xiàn)不同個體的藥效學(xué)結(jié)果差異較大的情況，如在A個體中藥物有效，在B個體中藥物無效。個體用藥后的藥效需要結(jié)合個體能夠引發(fā)的檢測體系的響應(yīng)強(qiáng)度綜合進(jìn)行判斷，必要時需要根據(jù)個體能夠引發(fā)的檢測體系的響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行分組來分析藥物的藥效學(xué)效果。
3.樣品穩(wěn)定性。Ex Vivo藥效學(xué)試驗的檢測樣品具備多元屬性，樣品中的藥物為檢測物質(zhì)，樣品中的生物材料如全血為檢測體系的試劑。通常情況下藥物較為穩(wěn)定，但是作為檢測試劑的生物材料并非穩(wěn)定的存在，全血在檢測體系的穩(wěn)定性通常為48-72小時以內(nèi)，個別項目要求24小時以內(nèi)， 甚至為8小時以內(nèi)，需要進(jìn)行嚴(yán)格的考察。樣品的檢測結(jié)果由樣品的藥物濃度和樣品的生物材料活性共同決定，在進(jìn)行樣品分析時需要確保樣品的生物材料活性出于最佳的狀態(tài)，這對樣品采集，運(yùn)輸和檢測時間均有較為嚴(yán)格的要求。同時由于樣品需要較短時間內(nèi)進(jìn)行分析，會導(dǎo)致Pre-dose，用藥后各采血點(diǎn)的樣品不能同時在一個分析批進(jìn)行分析，沒有標(biāo)準(zhǔn)曲線的對分析批信號的校準(zhǔn)，將會進(jìn)一步增加檢測結(jié)果的波動性。
4.樣品刺激體系的建立。通常情況下健康人用藥后，樣品中的藥物對樣品中的生物材料無明顯的藥效學(xué)作用，需要對樣品中的生物材料進(jìn)行刺激后，樣品中的藥物才能顯現(xiàn)出藥效學(xué)。刺激物的選擇，刺激時間的選擇，檢測目的分子和檢測平臺的選擇均需要基于藥物的作用機(jī)理，生物材料的生理學(xué)效應(yīng)進(jìn)行設(shè)計，一個類型的藥物需要一個類型的方法。在進(jìn)行Ex Vivo藥效學(xué)試驗時樣品中生物材料的運(yùn)輸保存和刺激，將會顯著性的影響檢測結(jié)果，是整個分析方法組成的一部分。在進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)和驗證過程中，將藥物加入生物材料中配制為模擬樣品進(jìn)行方法學(xué)驗證，是一個方法是否符合實際應(yīng)用的關(guān)鍵。
5.平臺和人員熟練度。Ex Vivo藥效學(xué)試驗時通常包括樣品的刺激和目的檢測分子檢測兩部分，樣品的刺激通常需要進(jìn)行全血，PBMC等生物材料的處理，由于該類型生物材料的個體差異和穩(wěn)定性較差，需要有較為豐富經(jīng)驗的人員。同時不同的藥效學(xué)方法檢測平臺不一樣，可能會使用如細(xì)胞，ELISA，F(xiàn)ACS，MSD，ELISPOT等試驗技能，一個完整的Ex Vivo藥效學(xué)試驗需要試驗人員兩方面能力均要有熟練度的要求，對人員和平臺的復(fù)合能力要求較高。
6.方法學(xué)驗證和數(shù)據(jù)匯報體系設(shè)計。Ex Vivo藥效學(xué)試驗無明確的指導(dǎo)原則，由于其非定量試驗類型，不能完全按照PK方法的參數(shù)進(jìn)行驗證，由于其存在個體差異，也不能完全按照免疫原性的參數(shù)進(jìn)行驗證，如果設(shè)計一個合適的方法學(xué)驗證體系來證明或者表征方法的精密度，靈敏性，特異性，穩(wěn)固性，穩(wěn)定性，基質(zhì)效應(yīng)等參數(shù)，確保能夠滿足真實樣品的檢測需求，需要基于多方面的考量。
綜上所述，Ex Vivo藥效學(xué)分析方法是難度非常大的分析方法，從方法的設(shè)計，方法學(xué)開發(fā)和方法學(xué)驗證，對人員和平臺均需要有較高的熟練度和經(jīng)驗需求，需要有專業(yè)化團(tuán)隊進(jìn)行完成。
基于藥物作用機(jī)理的了解和廣泛的文獻(xiàn)資料的檢索調(diào)研，熙寧生物專業(yè)化的Ex Vivo藥效學(xué)評估團(tuán)隊能夠為客戶的早期臨床藥物提供個性化的臨床藥效學(xué)評估解決方案，加速臨床研發(fā)進(jìn)度，助力臨床藥物研發(fā)的精細(xì)化管理，歡迎咨詢討論。
