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前言
隨著CTLA4抗體藥物，PD1抗體藥物， CD3-CD19雙抗blinatumomab，CD3-CD20雙抗Mosunetuzumab等相繼獲批上市，適應(yīng)癥不斷的拓寬，免疫治療在新藥研發(fā)領(lǐng)域深入人心。新的免疫調(diào)節(jié)劑靶點和免疫調(diào)節(jié)劑分子實體進入藥物研發(fā)階段，在關(guān)注其極佳的藥效學(xué)前景的同時，也需要要考慮其安全性風(fēng)險。免疫調(diào)節(jié)劑，特別是免疫激動劑，CD3 based多特異抗體均屬于臨床高風(fēng)險產(chǎn)品，對于此類產(chǎn)品IND申報前，CDE發(fā)布最新版本的《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》指出，完整的非臨床評價需要整合所有可用的體內(nèi)和體外試驗數(shù)據(jù)。除了在常規(guī)的動物體內(nèi)毒性試驗中進行細胞因子相關(guān)檢測外，還應(yīng)進行體外細胞因子釋放試驗。當(dāng)體內(nèi)試驗結(jié)果為陰性時，體外試驗陽性結(jié)果可以提示潛在臨床安全風(fēng)險。體外細胞因子釋放試驗該如何做？得到的數(shù)據(jù)該如何解讀？對于首次人體臨床劑量的選擇有何指導(dǎo)意義？筆者將通過TGN1412引發(fā)的災(zāi)難性的臨床事件以及原因探尋，英國NIBSC 組織國際著名藥企的能力測評，以及熙寧的體外細胞因子釋放試驗檢測實踐三方面對體外細胞因子釋放試驗進行介紹說明。
起源：CD28激動劑TGN1412臨床事件以及原因探尋
TGN1412是一款靶向T細胞的共刺激受體CD28的超級激動劑，在2006年該抗體第一次進入人體臨床實驗時，6個健康的受試者在注射該抗體的90分鐘之內(nèi)便產(chǎn)生了嚴(yán)重的危機生命安全的細胞因子風(fēng)暴。開發(fā)該抗體的公司TeGenero Immuno Therapeutics也在一年后宣布破產(chǎn)。事后的分析確認用于臨床實驗抗體的成品是符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的，尤其是排除了可能引起細胞因子風(fēng)暴成因的內(nèi)毒素的污染。這說明在臨床前研發(fā)階段TGN1412的免疫毒性實驗結(jié)果對人體內(nèi)的安全性預(yù)測失敗。這些臨床前的實驗包括體外試驗評估，即體外人和其他物種的PBMC/全血細胞進行細胞因子釋放的測定，也包括體內(nèi)試驗評估，即親緣相近的靈長類哺乳動物食蟹猴的體內(nèi)實驗測定細胞因子釋放。
關(guān)于TGN1412臨床前研發(fā)階段的體內(nèi)和體外免疫毒性實驗結(jié)果對人體內(nèi)的安全性預(yù)測的失敗原因的探尋，筆者認為醫(yī)藥研發(fā)行業(yè)和監(jiān)管機構(gòu)得到了兩個非常有價值的結(jié)論。
第一個是，對于免疫激動劑，在進行臨床前動物實驗時，需要對動物進行是相關(guān)性界定，采用不相關(guān)性動物模型進行免疫激動劑的藥理毒理評估將會重新走上TGN1412的悲劇道路，是需要極力避免的。如圖1，以下是筆者對于相關(guān)性動物的理解：
圖1：相關(guān)性動物界定
與非人靈長類動物（NHPs）相比，人類T細胞通過T細胞受體激活后，具有更強的增殖反應(yīng)。具體的原因可能是相對于非人靈長類動物，人的CD33相關(guān)的siglec糖蛋白有明顯的下調(diào)。CD33-siglec糖蛋白軸具備抑制T細胞激活的重要調(diào)節(jié)功能。基于此點，免疫調(diào)節(jié)劑使用非人靈長類動物（NHPs）進行臨床前體內(nèi)的免疫毒性評估，均有低估其免疫毒性的風(fēng)險。
第二個是對于免疫調(diào)節(jié)劑，體外細胞因子釋放試驗該如何進行設(shè)計和試驗，才能有效的預(yù)測或者外推到首次進入人體的安全劑量。關(guān)于此點英國NIBSC （National Institute for Biological Standards and Control）組織采用更加相關(guān)性的人PBMC設(shè)計了6種TGN1412和人PBMC刺激作用模型，如圖2。實驗結(jié)果表明TGN1412上臨床前的兩種體外實驗方案（1，2）并不能很好模擬人體內(nèi)TGN1412和與人免疫細胞的相互作用。體外和體內(nèi)結(jié)果的回顧性比較顯示，體外的4，5，6三種實驗方案（固-液作用模式，合適足夠的TGN1412劑量）可能更加貼近體內(nèi)TGN1412與人免疫細胞的作用模式。
圖2： TGN1412體外試驗的6種模型
筆者認為基于免疫調(diào)節(jié)劑調(diào)動人體免疫系統(tǒng)的復(fù)雜的相互作用，需要我們對單一目的的體外細胞因子釋放試驗實驗進行多樣化實驗條件的設(shè)計，安全性測定要做全的同時，也要做多，做到細致，同時對于檢測數(shù)據(jù)要有專業(yè)化的解讀。
標(biāo)準(zhǔn)化：英國NIBSC組織國際大藥企進行的體外細胞因子釋放試驗?zāi)芰y評
體外細胞因子釋放試驗該如何做？結(jié)果的可信度怎么樣？NIBSC在2020年組織了國際上知名大藥企，包括Amgen, Pfizer, Roche,GSK，BMS等共同進行了一次能力測評和國際協(xié)作研究，并選定了CD3抗體OKT3, CD28抗體TGN1412, CD52抗體Campath-1H作為測評的陽性藥物，值得業(yè)界同仁借鑒學(xué)習(xí)，如圖3，以下是筆者對于試驗?zāi)Ｊ降目偨Y(jié)：
圖3：NIBSC免疫調(diào)節(jié)劑體外細胞因子試驗?zāi)Ｐ鸵?/p>
各大藥企基本達成了共識，即應(yīng)該采用多種藥物作用模式進行免疫調(diào)節(jié)劑的體外細胞因子釋放試驗，但是各大藥企采用的模式通常不完全一樣，如何確保其采用的模式能夠達到預(yù)期體內(nèi)安全性風(fēng)險的目的，得到可信賴的結(jié)果，使用一個可信的陽性對照和陰性對照來確保檢測平臺檢測結(jié)果的可靠性顯得極為重要。由于采用個體的全血和PBMC進行測定，檢測結(jié)果通常會存在個體差異，檢測結(jié)果有較大的波動范圍，匯集了多個藥企采集了接近100個個體的檢測數(shù)據(jù)范圍將是一個很好的判斷體外細胞因子釋放試驗結(jié)果是否可靠參考標(biāo)準(zhǔn)，如下圖4所示，采用固相作用模式檢測陽性對照對PBMC刺激作用的體外細胞因子釋放各細胞因子的檢測結(jié)果如下：
圖4：體外細胞因子試驗NIBSC披露的數(shù)據(jù)
方案設(shè)計和數(shù)據(jù)分析：熙寧生物體外細胞因子釋放試驗實踐
免疫調(diào)節(jié)劑的臨床前體外細胞因子釋放需要基于藥物的作用機理進行方案的設(shè)計，需要盡可能用體外的方法來模擬體內(nèi)藥物和免疫細胞的作用模式，這是體外方法能夠有效預(yù)測體內(nèi)情況的基礎(chǔ)。由于免疫系統(tǒng)互作的復(fù)雜性，不同免疫調(diào)節(jié)劑的作用機理并不相同，一個盡可能全面考慮不同藥物作用模式的實驗方案設(shè)計是得到有效數(shù)據(jù)和進行數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)。熙寧生物基于對體外細胞因子釋放試驗的深刻認知，結(jié)合相關(guān)文獻報道分析，推薦的體外細胞因子釋放試驗?zāi)Ｐ秃妥兞咳缦拢?/p>
圖5：熙寧推薦的免疫調(diào)節(jié)劑體外細胞因子試驗?zāi)Ｐ鸵?/p>
1.藥物作用模式使用液相，濕法包被和干法包被，可以對藥物作用于靶點是單價起效，多價起效，或者Cross-link模式多聚態(tài)起效等藥物作用模式進行全面表征。
2.效應(yīng)細胞至少包括PBMC和全血，可考慮稀釋后全血，全血作為效應(yīng)細胞更加貼近真實的生理情況，但是對免疫調(diào)節(jié)劑的刺激會比較鈍化；PBMC作為效應(yīng)細胞對于免疫調(diào)節(jié)劑的刺激會比較敏感，通常會得到陽性的數(shù)據(jù)，稀釋后的全血通常情況下對于免疫免疫調(diào)節(jié)劑的刺激敏感度是介于全血和PBMC之間。
3.藥物作用測定濃度選擇在0.25ug/mL-10ug/mL，大致類比于體內(nèi)的藥物濃度12.5ug/KG-500ug/KG, 可根據(jù)藥物計劃的劑量進行進一步調(diào)整。
4.陽性對照選擇CD28抗體TGN1412和CD3抗體OKT3，兩者在臨床試驗中證實有較強的免疫因子釋放，并且兩者對免疫系統(tǒng)的刺激的作用機理并不完全相同，可以用于評估不同的藥物作用模式的異同。
5.細胞因子根據(jù)《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》檢測IL-2, IL-6, TNFα，IFN-γ，IL10，可采用MSD進行多因子檢測，或者性價比較高使用ELISA進行檢測。
6.至少進行三個受試者進行測試，每個受試者均進行全血和PBMC的檢測。
熙寧生物有豐富臨床免疫細胞藥效學(xué)檢測經(jīng)驗和臨床前的體外細胞因子釋放試驗，根據(jù)上述方案設(shè)計，進行多樣化的藥物作用模式，使用陽性對照CD28抗體TGN1412和CD3抗體OKT3進行測試，部分檢測結(jié)果如圖6，如IL2的分泌情況如下：
圖6：體外細胞因子試驗熙寧得到的部分?jǐn)?shù)據(jù)
上述檢測結(jié)果和NIBSC披露出來的數(shù)據(jù)具備高度一致性，從試驗結(jié)果也能得出以下的觀點：
1.多種體外試驗?zāi)Ｐ驮谕环N免疫調(diào)節(jié)劑中，細胞因子釋放的強度差異非常明顯。
2.不同的免疫調(diào)節(jié)劑在用一種體外試驗?zāi)Ｐ湍Ｐ椭?，細胞因子的釋放強度差異明顯。
3.同一種免疫調(diào)節(jié)機在不同的體外刺激模型中，細胞因子的釋放強度差異明顯。
不同的免疫調(diào)節(jié)劑在不同的體外試驗?zāi)Ｐ椭杏胁煌慕Y(jié)果，同時也能得到一些趨勢較為一致的結(jié)果，即
1.PBMC作為效應(yīng)細胞相對于全血有較強的刺激效果
2.包被相對于液相有較強的刺激效果
3.干法包被相對于濕法包被相，在CD28抗體TGN1412中有更強的刺激效果，在CD3抗體OKT3中有較弱的刺激效果，可能跟藥物的作用機理相關(guān)。
總結(jié)討論：
對于免疫調(diào)節(jié)劑的臨床前試驗，特別是免疫激動劑和CD3 Based雙抗來說，動物模型往往缺乏相關(guān)性，需使用人的PBMC用體外的檢測方法有效性評估和安全性評估，作為完整的非臨床評價最為重要的一部分，如下圖，F(xiàn)DA甚至發(fā)文推薦使用人的免疫細胞用體外的檢測方法得到的數(shù)據(jù)作為首次人體用藥劑量的最為參考因素。中國CDE發(fā)布最新版本的《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》指出完整的非臨床評價需要整合所有可用的體內(nèi)和體外試驗數(shù)據(jù)。除了在常規(guī)的動物體內(nèi)毒性試驗中進行細胞因子相關(guān)檢測外，還應(yīng)進行體外細胞因子釋放試驗。當(dāng)體內(nèi)試驗結(jié)果為陰性時，體外試驗陽性結(jié)果可以提示潛在臨床安全風(fēng)險。
圖7：FDA推薦使用體外試驗數(shù)據(jù)用于免疫激動劑的首次人體用量外推
體外細胞因子釋放試驗由于免疫調(diào)節(jié)劑作用機理的復(fù)雜性，試驗設(shè)計需要有多樣化的技術(shù)方案，體外細胞因子釋放試驗必須要做，如何做才算完整，得到的數(shù)據(jù)如何解讀，并對免疫調(diào)節(jié)劑的首次臨床劑量選擇起到怎樣的指導(dǎo)作用，這都需要有專業(yè)化的認知和實際經(jīng)驗才能進行把控。熙寧生物有豐富的免疫調(diào)節(jié)劑IND申報必檢項-體外細胞因子釋放試驗的項目經(jīng)驗，能夠提供性價比最高的優(yōu)質(zhì)服務(wù)，歡迎咨詢討論。
參考資料：
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6.CDE發(fā)布最新版本的《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》
7.熙寧生物非臨床體外試驗評價服務(wù)介紹.PPT
