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1.PROTAC概念介紹
PROTAC (Proteolysis Targeting Chimeras，蛋白降解靶向聯(lián)合體) 是一種利用泛素－蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）對靶蛋白進行降解的藥物開發(fā)技術（圖1A）。PROTAC是一種異雙功能分子，由結合靶蛋白（Protein of Interest，POI）的配體通過“Linker”連接到E3泛素連接酶的配體組成。該分子促進靶蛋白、PROTAC和E3連接酶的三元復合物形成，并使靶蛋白泛素化，隨后，泛素化的POI被真核細胞中的內源性26s蛋白酶體識別和降解。例如，PROTAC分子ARV-825是由結合POI的配體、招募 E3 連接酶的配體和連接兩個區(qū)域的Linker制成的異雙功能降解劑，可以靶向降解BRD4（圖1B）。
圖1：A. PROTAC降解靶蛋白示意圖；B. 降解劑ARV-825的結構及其作用機制
2.PROTAC研發(fā)現(xiàn)狀
2001年，Crews小組報導了第一個PROTAC分子。近20年來，特別是2015年以來，PROTAC 領域進入了快速發(fā)展期。迄今為止，已經公開了多種基于不同 E3 連接酶和蛋白質配體的 PROTAC降解劑，可以降解不同類型的靶蛋白。6月9日，清華大學藥學院饒燏團隊在Signal Transduction and Targeted Therapy 雜志上發(fā)表了一篇綜述論文，其中提到，2020-2021年新增了約90個可被PROTAC降解的蛋白質靶標，這遠超此前18年的總量（40多個），這表明——蛋白質降解時代已經到來。
由于其獨特的作用機制，PROTAC已被開發(fā)用于癌癥、免疫相關疾病、病毒感染、神經退行性疾病等疾病的治療，多款項目已經進入臨床開發(fā)階段。截止2022年3月，全球約有十幾個PROTAC進入臨床開發(fā)階段，處于臨床前的項目還有110個左右。目前，PROTAC 藥物在全球暫無相關產品獲批，進展最快的四個國際大型藥企為Arvinas、Kymera、C4 Therapeutics（簡稱“C4T”）、Nurix。其中，Arvinas公司的ARV-110、ARV-471已進入臨床Ⅱ期。同時，一些國內新藥公司管線也有產品推進到臨床Ⅰ/Ⅱ期，出現(xiàn)在國際最前沿，包括百濟神州、開拓藥業(yè)、海創(chuàng)藥業(yè)、海思科、珃諾生物等。
表1：全球臨床和IND階段基于PROTAC技術的蛋白質降解候選藥物
3.PROTAC的優(yōu)勢
（1）不依賴“占位驅動”
從作用模式（Mode of Action，MOA）來看，傳統(tǒng)的小分子和抗體藥物都是需要抑制劑或單抗具備較高的濃度來占據靶點的活性位點，從而阻斷下游信號通路的轉導來發(fā)揮治療疾病的作用，這種作用模式稱為“占位驅動”。而PROTAC是“事件驅動”，只要產生結合作用就可以誘導相關靶蛋白的降解。
（2）可靶向“不可成藥”靶點
大多數小分子藥物或單抗需要結合酶或受體的活性位點來發(fā)揮作用，然而，據估計，人類細胞中80%的蛋白缺乏這樣的位點。相比之下，PROTAC可以結合于靶蛋白表面的任何結合位點，更容易開發(fā)簡單有效和選擇性高的配體，作用于一些傳統(tǒng)意義上不可成藥的靶點。通過PROTAC技術靶向這些“不可成藥”靶點蛋白可能會使靶點從“不可成藥性”變成“可成藥性”，將在疾病治療中帶來前所未有的突破。
（3）提高選擇性
與傳統(tǒng)小分子抑制劑相比，利用小分子抑制劑設計開發(fā)的PROTAC在某些靶點上可實現(xiàn)更好的選擇性。當非選擇性抑制劑作為POI 配體合成PROTAC時，不僅POI配體可以識別相應的目標蛋白，而且可以誘導 POI 和 E3 連接酶之間特定的蛋白質-蛋白質相互作用形成三元復合物。PROTAC分子對靶點蛋白的選擇性可以理解為：一旦PROTAC和E3連接酶復合體形成二元復合體，對目標蛋白的結合位點附近的立體結構、凹槽深度、Linker旋轉自由度等有了更高的要求，從而減少了可靶向降解的目標蛋白。
（4）催化劑量、低頻次
PROTAC分子降解靶蛋白后能被循環(huán)利用，因此催化劑量即可產生很好的藥理活性。秦沖等人發(fā)現(xiàn)的靶向降解（bromodomain and extra-terminal）BET蛋白的QCA570在細胞抗增殖活性方面表現(xiàn)出了明顯優(yōu)于BET 抑制劑JQ1等抑制劑的能力，達到了皮摩爾級水平。此外，PROTAC引發(fā)靶蛋白降解后，能夠從復合物中解離，并進入下一個催化循環(huán)。一旦先前存在的蛋白耗盡，PROTAC只需要降解重新合成的靶蛋白，而大多數蛋白質的再合成速度很慢。因此使用PROTAC可以延長藥物作用時間，減少用藥頻次。
（5）延長作用時間
靶蛋白的降解是時間依賴性的，PROTAC可以在幾分鐘內將細胞內靶蛋白消耗到接近基礎水平。即使在PROTAC完全清除后，細胞可能仍需要一段相當長的時間，才能將蛋白質庫恢復生理信號的水平，從而大大延長作用時間。
（6）克服藥物耐用性
盡管臨床上應用了多種治療方法，但小分子抑制劑或拮抗劑在臨床用藥過程中，不可避免的都會發(fā)生獲得性耐藥。此外，目前對靶標的探索的重點是它們的酶促功能，而忽略了它們的支架部分的功能。與其事件驅動的藥理學一致，PROTAC對目標蛋白的催化去除和整體降解是由結合靶蛋白而不是功能破壞驅動，非常適合治療許多臨床相關的、靶向治療誘導的耐藥機制。 這包括 1) 藥物結合點突變而受損；2) 突變導致靶點組成激活；3) 突變誘導結合域構象變化；4) 通過靶點復合物重排獲得支架功能；5) 靶蛋白過表達；；6) 競爭加劇來自內源性配體；7) 剪接突變。 PROTAC 可以基于中性結合劑構建，該結合劑可以結合靶蛋白的任何位置，這為解決突變變異開辟了新的機會。因此，在突變導致現(xiàn)有配體的結合親和力完全喪失或結合位點喪失的情況下，可能會被用于開發(fā)新的 PROTAC結合劑。
4.PROTAC靶點選擇與設計
目前文獻報導的PROTAC可靶向降解不同類型的蛋白質，包括核受體（ER 和 AR等）、激酶 (Akt、BCR-ABL、c-ABL、BTK等)、轉錄因子 (Sirt2、HDAC6、TRIM24)、BET 溴結構域（BET蛋白）等。選擇合適的目標蛋白配體，是PROTAC分子可以降解靶蛋白的關鍵，主要包括天然產物、酶抑制劑以及多肽。Linker其實沒有一個特定的設計規(guī)律，主要有PEG，烷基，炔基，三唑環(huán)，哌嗪和哌啶等等，像ARV-110和ARV-471都是結合了哌嗪和哌啶設計的。人類基因組可以編碼600多個E3泛素連接酶，目前在PROTAC設計中僅使用了少數E3連接酶，包括Von Hippel-Lindau（VHL）、cereblon（CRBN）、the mouse double minute 2 homologue (MDM2)等。效果較好、使用頻次最高的E3連接酶主要是CRBN和VHL兩種。其中，CRBN的配體主要是來那度胺、泊馬度胺及其類似物，VHL的配體主要是VHL-L，各部分分類如圖2所示。
圖2：PROTAC靶點、配體、連接子、E3泛素連接酶類別
5.PROTAC的藥物代謝和藥代動力學（DMPK）挑戰(zhàn)
盡管PROTAC 具有良好的藥效潛力，但是其雙功能性質可能會導致物理化學特性，與傳統(tǒng)小分子藥物相比，專注于開發(fā)口服生物利用度降解劑的藥物將面臨復雜的藥物代謝和藥代動力學（DMPK）挑戰(zhàn)。它們的主要物理化學特征通常包括高分子量（700 ~ 1200 Da）、高極性表面積、大量可旋轉鍵以及較差的溶解性和滲透性。
（1）監(jiān)管機構（美國FDA或ICH）沒有針對特定DMPK挑戰(zhàn)的具體指導。實際上，小分子藥物的指導通常是根據具體情況提及的，但PROTAC與傳統(tǒng)的小分子有顯著不同。
（2）PROTAC的獨特結構使得很難符合Lipinski為小分子設計的五個規(guī)則。這些藥物的分子量通常落在700~1000 Da范圍內，溶解度差。但符合Lipinski的親脂性，氫鍵供體或受體和極地表面積的其他規(guī)則。
（3）PROTAC藥物的滲透性較差，導致口服藥物的藥物能力差，并且體外和體內滲透性之間的相關性較弱。同樣，小分子的體外通透性評估系統(tǒng)通常不適合PROTAC。
（4）PROTAC藥物已顯示出“hook” 效應（即，PROTAC在較大濃度的時候優(yōu)先形成的是POI-PROTAC和E3-PROTAC兩種二元復合物，影響三元復合物的形成，從而降低了療效或有毒反應）。這要求藥物研究界更清楚地了解PROTAC藥物的PK/PD特征和適當的劑量范圍。
（5）PROTAC的代謝產物，尤其是“l(fā)inker”切割代謝物，可能會競爭結合靶標或E3連接酶。與“hook” 效應相似，這種結合可降低功效。因此，代謝物的分析和鑒定是其臨床前篩查的關鍵部分，這不僅對于選擇適當的毒理學物種，而且對于理解劑量反應關系而言至關重要。
最近，Dr. Liping Ma提出了七個提高PROTACs口服生物利用度的策略：1）與食物一起服用；2）通過更改linker長度，更改鏈接器的錨點，使用循環(huán)鏈接器以及更改接頭的附件站點，以提高代謝穩(wěn)定性PROTAC分子的代謝穩(wěn)定性；3）優(yōu)化linker 結構改善細胞滲透性；4）選擇更小的E3連接酶配體；5）在PROTAC結構設計中引入分子內氫鍵從而降低分子大小和極性來促進細胞的滲透性；6）通過修飾藥理學活性化合物獲得前藥；7）使用其他蛋白降解劑比如分子膠代替PROTAC。
6.PROTAC生物分析
由于PROTAC分子結構和作用的機理，在生物分析中需要中需重點考察穩(wěn)定性。可通過向樣品中加入酶抑制劑或者低溫處理樣品來提高穩(wěn)定性。此外在方法開發(fā)中發(fā)現(xiàn)，可能由于其親脂性，有些PROTAC藥物存在一定的非特異性吸附，因此在PROTAC生物分析中需要關注該問題。如圖3所示，PROTAC藥物定量下限為1.00 ng/mL，通過蛋白沉淀進行樣品前處，從結果看，不管是干擾、靈敏度以及線性關系都是完全能滿足臨床樣品的檢測需求。此外本實驗還進行了穩(wěn)定性考察，如表2所示，不進行任何干預的情況下在實驗臺放置12小時樣品降解超過20.0%，進行一定的干預措施后樣品能夠在實驗臺維持至少10個小時，因此該條件能完全保證樣品采集和前處理過程中樣品的穩(wěn)定性。
A
B
C
圖3：A. 空白樣品圖譜；B. 定量下限圖譜；C. 標準曲線圖
表2：短期穩(wěn)定性數據表
7.結束
熙寧生物質譜平臺能夠提供符合NMPA/FDA/OECD/EMA的各項生物樣品分析服務，支持小分子藥物、多肽、寡核苷酸、PROTAC、ADC以及大分子抗體等藥物的方法開發(fā)、驗證和樣品檢測。平臺配備了多套高端液質聯(lián)用系統(tǒng)和Watson LIMS在內的生物分析系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)，各種先進輔助設備，不僅可以滿足各型實驗的檢測需求，還大大提高實驗效率和質量。 我們能夠更快、更好的為客戶提供專業(yè)的技術服務，更高效地幫助客戶完成藥品研發(fā)。
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