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前言
Tebentafusp是一款TCR/CD3雙特異融合蛋白藥物，靶向gp100表達的腫瘤，同時是首款以T細胞受體為骨架的大分子藥物。根據(jù)Immunocore和Adaptimmune披露Tebentafusp的臨床前的研究資料文獻，筆者梳理了α-CD3為骨架的雙特異藥物需要進行臨床前體外試驗，以及以人的免疫細胞為核心的，種屬特異性的體外試驗對首次人體試驗安全劑量的選擇的重要指導意義，討論臨床前以人免疫細胞的體外試驗模型取代非相關(guān)動物模型進行安全性、有效性評估和安全劑量預測的范式轉(zhuǎn)移的可行性，梳理臨床前體外試驗包的主要內(nèi)容。
Tebentafusp臨床前體外試驗
隨著CTLA-4抗體, PD1/PDL1抗體，CART和CD3 based雙特異藥物在近10年不斷獲批上市并廣泛應用腫瘤治療領(lǐng)域，腫瘤免疫療法已成為新的藥物研發(fā)的范式，不斷有腫瘤免疫相關(guān)的新靶點，新藥物形式實體從臨床前進入臨床。在腫瘤免疫治療藥物研發(fā)迅猛發(fā)展的同時，也暴露出了一些風險，其中影響比較深遠的是采用不合適的臨床前的藥物評估模型無法充分的預估臨床副作用導致的安全性風險。比較典型的案例是抗CD28抗體TGN1412在健康受試者中引起的劇烈的危機生命的細胞因子釋放綜合征，CD3/CD19雙抗藥物blinatumomab在病人中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)毒性等。究其原因是目前傳統(tǒng)的臨床前的動物模型用來預測人來源的免疫調(diào)節(jié)藥物的安全性和有效性并不合適，動物/人的免疫細胞/免疫蛋白和治療藥物的互作強度存在差異，人來源的治療藥物在動物體內(nèi)會產(chǎn)生抗藥抗體影響到藥代動力學分布，進而影響到安全性和有效性評估。
ICHS6 和 ICHS9 強調(diào)藥物的臨床前研究需要確保藥物在相關(guān)種屬具備藥物活性，如果做不到這點，可以考慮體外的方法。已經(jīng)有越來越多案例表明人種屬來源的體外試驗能夠產(chǎn)生有價值的，能夠為體內(nèi)預測提供有幫助性的結(jié)果，并且在臨床階段選擇最低預期生物有效水平（Minimal Anticipated Biological Effective Level）的起始濃度非常有指導意義。
以Tebentafusp的臨床前研究數(shù)據(jù)為典型案例，如下圖1 Immunocore和Adaptimmune的 科學家介紹了在有效性，安全性和特異性方面進行評價臨床前的體外方法的測試項。
圖1：臨床前體外試驗測試項
臨床前體外免疫學試驗包分析
Tebentafusp的臨床前體外免疫學試驗包總結(jié)下來可分為以下內(nèi)容：
有效性評估-體外人T細胞激活和殺傷，使用的方法分析
1. 基于人PBMC Tebentafusp介導特異性的腫瘤細胞殺傷試驗，采用的是LDH釋放殺傷模型, IncuCyte 凋亡檢測模型，結(jié)果間圖2
2. 基于人PBMC和特異性的腫瘤細胞作用，Tebentafusp介導的T細胞的激活測定，采用的是ELISPOT檢測IFNγ的T細胞激活性模型。
圖2：體外腫瘤細胞殺傷試驗結(jié)果
通過細胞殺傷試驗中Tebentafusp梯度稀釋的劑量結(jié)果，確定Tebentafusp在1pM-1nM的范圍內(nèi)有有效的殺傷效果，確定最低預期生物有效水平為1pM.
安全性評估-體外人T細胞激活和細胞因子釋放，使用的方法分析
1. 靶點特異性，非腫瘤特異性的活性測定。主要采用的是不同抗原表達豐度的腫瘤細胞，不同捐獻者的黑色素細胞進行對比評估，使用ELISPOT檢測T細胞的激活進行測試，結(jié)果見圖3。Tebentafusp在比較敏感的受試者中藥物濃度達到1pM-10pM會出現(xiàn)皮膚相關(guān)的副作用，在大部分受試者中10pM-100pM會出現(xiàn)皮膚相關(guān)的副作用，在1nM以上時會丟失特異性。
2. 非靶點，非腫瘤特異性的活性測定。主要采用的是在全血中Tebentafusp細胞因子釋放，檢測上清IL-6, TNF-α,IL-2 and IFNγ，文章沒有描述方法的細節(jié)，筆者認為基于TGN1412案例中的方法2，從安全性角度來說，全血的刺激應包括，液相刺激，濕法固相刺激和干法固相刺激等模型。
圖3：靶點特異性，非腫瘤特異性的活性測定
基于體外安全性的結(jié)果過大于1nM Tebentafusp會特異性減弱，結(jié)合有效性的檢測數(shù)據(jù)，最終確定的臨床劑量擴展的范圍在10pM-100pM.
總結(jié)討論：
根據(jù)相關(guān)文獻記載，與非人靈長類動物（NHPs）相比，人類T細胞激活后，具有更強的增殖反應。具體的原因可能是相對于非人靈長類動物，人的CD33相關(guān)的siglec糖蛋白有明顯的下調(diào)。CD33-siglec糖蛋白軸具備抑制T細胞激活的重要調(diào)節(jié)功能，所以免疫調(diào)節(jié)劑特別是免疫激動劑在非人的靈長類動物模型中，其免疫激活能力將會被低估，使用靈長類動物模型的安全劑量外推到人體用量，有極大的安全性風險，這也是CD28超級激動劑在首次人體試驗出現(xiàn)嚴重的臨床試驗的根本原因。
基于免疫調(diào)節(jié)劑的動物模型的非相關(guān)性，美國先后發(fā)表了An FDA oncology analysis of CD3 bispecific constructs and first-inhuman dose selection，An FDA oncology analysis of immune activating products and first-in-human dose selection兩篇文章推薦使用基于人免疫細胞的更加具備相關(guān)性的體外試驗模型的檢測結(jié)果進行CD3雙抗和免疫激動劑的人體首次用量劑量的外推。具體如圖4
圖4:FDA推薦使用體外的人免疫細胞試驗的數(shù)據(jù)外推首次人體劑量
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1.基于人PBMC的細胞殺傷腫瘤細胞檢測：
2．基于流式細胞技術(shù)進行人全血的T細胞增殖測定和藥物受體占位測定：
3. 基于ELISPOT平臺藥物作用下激活人PBMC激活的IFNγ檢測
4.基于液相，濕法固相和干法固相刺激模型人PBMC/全血的細胞因子釋放測定
