藥代動力學(xué)檢測
藥物代謝動力學(xué) (Pharmacokinetic, PK) 是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律,并運用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時間變化的規(guī)律的學(xué)科,血藥濃度隨時間變化的規(guī)律尤為重要。藥物濃度檢測方法建立中,針對藥物的獨特型抗體可特異性識別基質(zhì)中的藥物,是PK研究不可或缺的檢測試劑,而由于抗藥抗體特異性識別位點的不同,PK中檢測的藥物類型也就有了一定差別。
小劇場:
在蛋白類藥物的藥代動力學(xué)檢測的過程中,藥物檢測有不同的類型,主要有兩種:一種是檢測游離的藥物濃度,另一種是檢測總的藥物濃度,即包含游離的藥物以及和靶點結(jié)合的藥物濃度。PK檢測方式可根據(jù)臨床需求,藥物機(jī)制與檢測目的來決定。
檢測游離的藥物,通常采用競爭性的抗藥物抗體,即該抗體結(jié)合藥物的位點和藥物識別靶點的位點一致或是存在空間位阻。
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檢測總的藥物濃度,通常采用非競爭性抗體,藥物與靶點的結(jié)合并不能干擾抗體對藥物的捕獲能力。
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所以在PK方法開發(fā)的階段,首先要做的就是根據(jù)臨床的目的來篩選合適的抗體。
對于檢測總的藥物濃度的PK項目而言,非競爭性抗體的性能決定了方法的靈敏度。一旦抗體的非競爭性效果不好,那結(jié)合了靶點的藥物就不能被捕獲或者是檢測。
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眾所周知,抗體的制備有很大的偶然性,篩選到一對恰到好處的抗藥抗體是一件足夠幸運的事情。如果項目急,時間緊,想要測試總的藥物濃度,篩選的抗體非競爭性效果并不十分出色,那么就束手無策了嗎?并不是,實驗證明,PK藥物濃度檢測中的靶點干擾是可以被解決的。
pH對抗原抗體結(jié)合的影響
靶點干擾是基質(zhì)效應(yīng)中的一種類型,意味著基質(zhì)中游離的靶點會對PK檢測結(jié)果產(chǎn)生影響,尤其是當(dāng)基質(zhì)環(huán)境中存在高濃度靶點時(如ug/ml級別),通常會影響樣品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們常用的解決基質(zhì)效應(yīng)的辦法是增大MRD(最小稀釋倍數(shù)),但有時加大MRD并不會起效。下面示例一個Total PK的檢測方法,其靶點濃度高達(dá)10ug/ml, 結(jié)果顯示簡單的MRD處理并不能解決靶點帶來的干擾。
對于這種PK檢測,我們應(yīng)該怎么辦呢?
在大分子檢測領(lǐng)域,藥代動力學(xué)(PK)和免疫原性(ADA)的檢測因為都是配體結(jié)合實驗,所以具有很大的相通性。而在免疫原性的檢測中,靶點干擾是分析方法發(fā)展領(lǐng)域公認(rèn)的主要挑戰(zhàn)之一,現(xiàn)已提出多種前處理方式來緩解這一問題,如酸或堿解離,親和捕獲洗脫(ACE),酸解離固相萃取等等。既然相似,為何不借用一下它山之石呢?所以對于上述的有嚴(yán)重靶點干擾的PK檢測,我們果斷嘗試酸解離以及酸解離固相萃取的嘗試。
解決靶點干擾的兩種嘗試
酸化處理——打開藥物與靶點的預(yù)結(jié)合
這種方式首先要考慮檢測的藥物是否耐酸,要用什么酸,酸化pH為多少合適;其次考慮藥物與抗體的反應(yīng)體系pH,即酸化后的樣品采用什么堿液,酸堿比例多少合適,中和后的反應(yīng)體系后pH多少合適(中性,弱酸或弱堿),在這個方法中選擇了乙酸和Tris-HCL 緩沖液作為酸化和中和的Buffer,比較了不同pH反應(yīng)體系下干擾的結(jié)果(如下表,黃色為中性反應(yīng)體系,綠色為酸性反應(yīng)體系):
同時進(jìn)行了選擇性測試,在中性反應(yīng)體系中,選擇性通過率較低不能滿足指導(dǎo)原則要求,而在弱酸性條件下選擇性結(jié)果通過,滿足指導(dǎo)原則要求。
這表明,酸化處理并在弱酸性體系下反應(yīng)條件下靶點干擾的問題完美解決。
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酸化
SPEAD 固相萃取
酸化打開藥物與靶點的預(yù)結(jié)合,提取檢測目標(biāo),再酸化使其在Buffer環(huán)境中解離,去除基質(zhì)對檢測的影響。
這種方式與第一種方式相比,操作稍顯復(fù)雜,對實驗員的技能要求更高些,且完成一次檢測所需時間更長,但其最突出的優(yōu)點就是可以盡可能的去除基質(zhì)效應(yīng)。這種方式除了要考慮酸化處理需要考慮的問題之外,還需考慮提取體系的pH。比較不同提取體系效果的結(jié)果如下:
靶點干擾結(jié)果
從結(jié)果可知,SPEAD 固相萃取法也可很好的解決靶點干擾的問題。相比較單純酸處理而言,它有更好的窗口和靈敏度,但同時也增加了時間成本以及操作難度。實踐中,需考慮臨床對于方法參數(shù)的需求,成本,試劑可及性,方法穩(wěn)健性等各方便的要求,選擇更適合的方法。
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前情提要:樣品經(jīng)過酸化后,藥物與靶點的結(jié)合已打開,藥物與抗體重新結(jié)合······
固相萃取
結(jié)語
當(dāng)然,以上處理的小技能并不是萬能的,并非一切有關(guān)基質(zhì)效應(yīng)的問題都可以用它來解決,而且雖然在ADA的檢測中酸化處理樣品已經(jīng)是一個很成熟的辦法,但是將其用于PK檢測時也遇到很多的問題。與ADA相比,PK檢測更加的嚴(yán)苛,是定量的檢測,酸化的方法并沒有常規(guī)方法穩(wěn)健等種種問題,上面只是提供一種思考方式,當(dāng)我們在分析工作中遇到問題時,可打開思維,尋找新的出路。
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熙寧生物|精翰生物免疫分析團(tuán)隊具有20多年的PK檢測分析經(jīng)驗,藥物類型覆蓋單克隆抗體、雙/多特異性抗體、ADC、融合蛋白/重組蛋白,其中單克隆抗體>50種,雙/多特異性抗體>30個藥物,40+臨床試驗,ADC類藥物>15種,20+臨床試驗,在實戰(zhàn)種積累了大量的經(jīng)驗,可為申辦方提供一站式的檢測分析服務(wù),歡迎前來交流溝通。