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隨著新藥研發(fā)的靶點(diǎn)越來越新，創(chuàng)新藥研發(fā)從Fast Follow到First in Class, Best in 、Class大步調(diào)邁進(jìn)，新興靶點(diǎn)的藥物實(shí)體在臨床早期是否能夠看到有效性的信號是需要迫切回答的問題，也是藥物研發(fā)企業(yè)決定該藥是否進(jìn)入臨床Ⅱ期進(jìn)行風(fēng)險控制的重要決策因素。國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心密集發(fā)布《模型引導(dǎo)的藥物研發(fā)技術(shù)指導(dǎo)原則》，《以患者為中心的臨床試驗(yàn)設(shè)計技術(shù)指導(dǎo)原則》，《以臨床價值為導(dǎo)向的抗腫瘤藥物臨床研發(fā)指導(dǎo)原則》等指導(dǎo)性文件，這也要求新藥研發(fā)企業(yè)在臨床早期提供藥物有效性相關(guān)的數(shù)據(jù)來支撐新藥進(jìn)入ⅡⅢ期臨床，保護(hù)臨床受試者的權(quán)益，提高臨床公共醫(yī)療資源配置效率。在臨床Ⅰ期進(jìn)行藥物藥理藥效生物標(biāo)志物檢測是回答上述問題，來滿足監(jiān)管需求的最佳技術(shù)解決路徑。本文將藥效學(xué)生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用，生物分析內(nèi)容和策略，以及臨床生物分析案例對藥效生物標(biāo)志物的臨床檢測進(jìn)行闡述。
美國的NIH對藥效生物標(biāo)志物有一個非常恰當(dāng)?shù)亩x1，翻譯下來如下：
藥效學(xué)(PD)生物標(biāo)志物是藥物作用于生物體內(nèi)靶點(diǎn)的效應(yīng)分子指標(biāo)。PD生物標(biāo)志物可用于檢驗(yàn)臨床給藥方案、靶標(biāo)效應(yīng)和腫瘤生理學(xué)響應(yīng)之間的聯(lián)系。在新藥開發(fā)階段重點(diǎn)PD生物標(biāo)志物測量可提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)，以做出明智的、早期的繼續(xù)/不繼續(xù)決策，選擇合理的靶向藥物組合，并優(yōu)化聯(lián)合藥物方案等。鑒于藥效需學(xué)生物標(biāo)志物在靶向治療藥物研發(fā)中的關(guān)鍵作用，經(jīng)過驗(yàn)證和可靠的臨床PD檢測方法是必要的。
藥效生物標(biāo)志物大致主要有兩種臨床應(yīng)用：
一、早期研究中尚無法確定與臨床結(jié)果最相關(guān)的藥效學(xué)生物標(biāo)志物時，可將多個藥效學(xué)生物標(biāo)志物以及藥代動力學(xué)特征相結(jié)合，為R2PD劑量選擇提供重要依據(jù)。例如，在布魯頓氏酪氨酸激酶（BTK）抑制劑的開發(fā)過程中，BTK靶點(diǎn)占有率，可作為選擇臨床推薦劑量和給藥方式的重要依據(jù)2。在模型引導(dǎo)的藥物研發(fā)（MIDD）中，藥效學(xué)生物標(biāo)志物是建模和分析的核心因素。
二、用與臨床結(jié)局建立明確相關(guān)性的藥效學(xué)生物標(biāo)志物作為替代終點(diǎn)，縮短研發(fā)周期，使有效的藥物更早惠及患者。比如生存期延長是腫瘤藥物研發(fā)中反映臨床獲益的金標(biāo)準(zhǔn)，因此在抗腫瘤藥物臨床試驗(yàn)中，通常采用反映生存獲益的指標(biāo)總生存時間（OS）或被證實(shí)與OS相關(guān)的替代終點(diǎn)（如無進(jìn)展生存時間）作為主要終點(diǎn)支持監(jiān)管決策。采用上述終點(diǎn)時，往往研究周期較長。
在創(chuàng)新藥物臨床研發(fā)前沿，多采用藥效生物標(biāo)志物結(jié)果，結(jié)合藥代動力學(xué)特征數(shù)據(jù)，用于R2PD劑量選擇或者跟監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行溝通，可作為藥物有效性的重要依據(jù)。基于臨床Ⅰ期的藥效生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)進(jìn)行Ⅱ期臨床決策，是對Ⅰ期看安全性和最大藥物耐受，Ⅱ期看有效性等教科書式刻板印象的挑戰(zhàn)，也是藥物從化療藥物到靶向藥物迭代的智慧選擇。
從生物分析臨床實(shí)踐角度，藥效生物標(biāo)志物以待檢測標(biāo)志物是否能夠拿到合適的標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)可分為兩類：定量型生物標(biāo)志物和非定量型生物標(biāo)志物。定量型和非定量型藥效生物標(biāo)志物的方法學(xué)開發(fā)難度，方法學(xué)開發(fā)和驗(yàn)證內(nèi)容有著較大的差異，需要區(qū)別進(jìn)行對待。
定量型藥效生物標(biāo)志物的分析策略：
定量型藥效生物標(biāo)志物通常能夠通過蛋白重組技術(shù)在體外表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)，基于標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對臨床樣品的生物標(biāo)志物在檢測體系中的信號值進(jìn)行濃度的回算預(yù)測，通常臨床檢測樣品為血清、血漿，腦脊液等液體基質(zhì)，采用ELISA/MSD等LBA方法進(jìn)行檢測。定量型藥效生物標(biāo)志物的方法學(xué)開發(fā)和驗(yàn)證過程大體可參考抗體藥物PK檢測的技術(shù)路徑如《ICH M10：生物分析方法驗(yàn)證及樣品分析》，需要進(jìn)行精密度，準(zhǔn)確度，靈敏度，稀釋線性等方法學(xué)驗(yàn)證。但也有一些區(qū)別，關(guān)鍵點(diǎn)在于需要在方法學(xué)開發(fā)和驗(yàn)證階段，考察檢驗(yàn)檢測體系中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品的待測物質(zhì)是否有了類似的劑量曲線，需要進(jìn)行平行性和選擇性檢驗(yàn)，如圖1。平行性和選擇性檢驗(yàn)內(nèi)容可參考筆者寫的另一篇文章3，在此不做詳述。
圖1. 定量型生物標(biāo)志物平行性和選擇性驗(yàn)證內(nèi)容
非定量型藥效生物標(biāo)志物的分析策略：
非定量型藥效生物標(biāo)志物通常拿不到標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)，需要基于檢測的信號值進(jìn)行藥效生物標(biāo)志物的強(qiáng)度表征，存在較大的批間差異。該類型的藥效標(biāo)志物臨床樣品通常為人體腫瘤組織或者全血PBMC等，采用IHC，流式，LBA，細(xì)胞學(xué)等方法進(jìn)行檢測。非定量型藥效生物標(biāo)志物檢測方法多樣，通常為用藥前后細(xì)胞胞內(nèi)或者胞外膜蛋白表達(dá)豐度，受體占位，胞內(nèi)磷酸化蛋白，甲基化蛋白等指標(biāo)的變化情況作為檢測對象，具備功能學(xué)檢測特征。如下圖2。某合成致死抑制劑存在的幾種臨床藥效生物標(biāo)志檢測方式，以及優(yōu)劣如下：
圖2. 非定量型生物標(biāo)志物臨床檢測路徑
在制定藥效學(xué)生物標(biāo)志物檢測方案前，需要對定量型藥效生物標(biāo)志物和非定量型生物標(biāo)志物進(jìn)行合理區(qū)分。非定量型生物標(biāo)志物檢測多為功能學(xué)檢測，其方法具有難度較大，檢測技術(shù)路徑不明確，模式不固定，樣品穩(wěn)定性較差等特點(diǎn)，因此需要較長的方法學(xué)開發(fā)周期和強(qiáng)大的方法學(xué)開發(fā)技術(shù)能力，在臨床樣品分析階段如果方法學(xué)開發(fā)和驗(yàn)證沒有做好，很可能會出現(xiàn)藥物濃度和藥效學(xué)生物標(biāo)志物變化不明顯，甚至反轉(zhuǎn)的情形，風(fēng)險較大。
非定量型藥效生物標(biāo)志物方法學(xué)開發(fā)難度較大，因此需要基于藥物作用機(jī)理，生物標(biāo)志物生理學(xué)特征，臨床樣品可及性，以及方法學(xué)參數(shù)性能等多方面進(jìn)行考量，從而制定合適的分析策略。
部分示例如下：
基于血漿基質(zhì)的PIA檢測方法
采用刺激劑A和B刺激Jurkat的細(xì)胞系，檢測不同的藥效生物標(biāo)志物的刺激效果和方法學(xué)信號窗口，選擇合適的檢測體系。基于血漿中藥物在檢測體系中和藥效生物標(biāo)志物的藥效相關(guān)性選擇合適的刺激劑，生物標(biāo)志物等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行臨床樣品的藥效生物標(biāo)志物分析。
基于PBMC基質(zhì)的流式檢測方法
基于全血PBMC的免疫分型，以及藥物在特定細(xì)胞亞群中翻譯后修飾蛋白的藥效相關(guān)性建立流式檢測體系。采用特定細(xì)胞亞群的檢測方法相對于采用PBMC裂解MSD檢測方法，有更佳的信號窗口，方法學(xué)穩(wěn)固性以及藥效相關(guān)性。
基于PBMC裂解液的ELISA方法
采用PAR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，腫瘤細(xì)胞系，PBMC，全血PBMC逐層推進(jìn)的方法優(yōu)選出合適的針對全血樣品裂解液中PAR（poly ADP-ribose）的特異性抗體對，以及建立藥物和PAR（poly ADP-ribose）的藥效相關(guān)性性檢測體系，有優(yōu)于試劑盒的性能。
基于腫瘤組織的IHC方法
采用篩選的γH2AX特異性抗體，進(jìn)行用藥前后腫瘤組織的γH2AX免疫組化染色，建立藥物用藥劑量和γH2AX的藥效相關(guān)性。
基于血清基質(zhì)的抗體藥物ADCC功能
構(gòu)建NUGC4 luciferase單克隆細(xì)胞系，優(yōu)化PBMC和NUGC4 luciferase單克隆E:T比，建立穩(wěn)固的基于血清樣品的抗體藥物介導(dǎo)的ADCC功能檢測體系，檢測窗口可達(dá)50倍，方法學(xué)穩(wěn)固。
藥效學(xué)生物標(biāo)志物的臨床生物分析策略需要基于藥物作用機(jī)理，生物標(biāo)志物生理學(xué)特征，臨床樣品可及性和穩(wěn)定性，以及方法學(xué)參數(shù)性能等多方面進(jìn)行考量，制定不同的分析策略。熙寧生物|精翰生物由多位博士組成的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)可進(jìn)行特定藥效學(xué)方法的方案設(shè)計與評估，目前也已有完備的功能學(xué)檢測方法庫，可進(jìn)行臨床藥效相關(guān)性模型的搭建和藥效生物標(biāo)志物的篩選探索工作，可優(yōu)化組合最適宜的方法學(xué)條件和藥效標(biāo)志物，確保臨床藥效生物標(biāo)志物檢測的方法學(xué)性能。
熙寧生物|精翰生物有齊全的技術(shù)平臺和專業(yè)化的團(tuán)隊(duì)專注于臨床藥理藥效學(xué)生物分析領(lǐng)域，對于預(yù)期難度較高的檢測項(xiàng)目可同時進(jìn)行多技術(shù)平臺（IHC，流式，LBA和qPCR等）的方法學(xué)開發(fā)，優(yōu)選檢測方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。目前已積累了豐富的臨床階段藥效學(xué)實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)，包括100+定量藥效生物標(biāo)志物和50+非定量藥效生物標(biāo)志物方法學(xué)開發(fā)，驗(yàn)證和樣品分析，可基于臨床采集運(yùn)輸前處理檢測的全生命周期流程進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)和驗(yàn)證，，歡迎咨詢交流。
參考文獻(xiàn)：
[1].https://next.cancer.gov/developmentresources/pd_biomarker.htm
[2].Bilal Tariq, Ying C. Ou, Jennifer C. Stern, Vaibhav Mundra, Nicole Wong Doo, Patricia Walker, Katharine L. Lewis, Chester Lin, William Novotny, Srikumar Sahasranaman, Stephen Opat. (2023) A phase 1, open-label, randomized drug–drug interaction study of zanubrutinib with moderate or strong CYP3A inhibitors in patients with B-cell malignancies. Leukemia & Lymphoma 64:2, pages 329-338.
[3].生物標(biāo)志物方法質(zhì)量和方法驗(yàn)證參數(shù)關(guān)聯(lián)的深度解析（1）
