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酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（Enzyme Linked Immunospot Assay，簡稱ELISPOT）是細(xì)胞免疫學(xué)研究中最敏感的檢測方法，可以在單細(xì)胞水平對抗體分泌細(xì)胞(如B細(xì)胞)及細(xì)胞因子分泌細(xì)胞（如T細(xì)胞）進(jìn)行檢測，可達(dá)20-25斑點(diǎn)/100萬細(xì)胞，由于該方法是進(jìn)行抗原刺激后免疫細(xì)胞的功能性檢測，因此也具有極佳的生理相關(guān)性。
ELISPOT常用于疫苗領(lǐng)域藥效學(xué)評估, 是mRNA感染性疫苗和mRNA/DC腫瘤疫苗藥效學(xué)評估中關(guān)鍵的技術(shù)方法，也是AAV based藥物細(xì)胞免疫原性評估重要的技術(shù)手段。
ELISPOT基本原理是通過免疫細(xì)胞和對應(yīng)刺激物進(jìn)行共培養(yǎng)，類似于ELISA雙抗夾心法對有刺激反應(yīng)的免疫細(xì)胞進(jìn)行檢測。由于免疫細(xì)胞激活機(jī)理的復(fù)雜性性，根據(jù)免疫細(xì)胞的來源選擇，刺激物的類型，刺激方式的不同會衍生出不同的應(yīng)用方向，以及不同靈敏度的ELISPOT檢測方法，簡要的技術(shù)流程如圖1所示：
圖1. ELSIPOT檢測流程圖
在基因治療藥物的臨床生物分析實(shí)踐中，細(xì)胞免疫原性檢測有諸多的難點(diǎn)：
1. ELISPOT通常需要刺激物和對應(yīng)陽性PBMC才能進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，在實(shí)際的方法學(xué)驗(yàn)證過程中由于刺激物對應(yīng)的陽性PBMC不易獲取，的因此有些檢測機(jī)構(gòu)的做法是，方法并不進(jìn)行驗(yàn)證。即使進(jìn)行驗(yàn)證也通常采用CEF作為刺激物，篩選健康人PBMC作為陽性PBMC進(jìn)行方法學(xué)的精密度，穩(wěn)定性以及穩(wěn)固性驗(yàn)證，從而證明整體平臺體系的可靠性。熙寧生物秉持嚴(yán)謹(jǐn)可靠的方法開發(fā)驗(yàn)證質(zhì)量要求，除采用CEF刺激陽性PBMC作為主體驗(yàn)證外，基于對于基因治療藥物原理的了解，在正式樣品分析前會進(jìn)行專屬于該基因治療藥物的特異性較差驗(yàn)證，如對于AAV治療藥物，會基于AAV病毒載體存在預(yù)存的陽性PBMC，對于AAV藥物的細(xì)胞免疫原性檢測，篩選出健康人群體中的陽性PBMC，進(jìn)行AAV衣殼蛋白多肽庫的交叉驗(yàn)證，確保在進(jìn)行樣品分析前檢測方法的可靠性。
2. ELISPOT的檢測結(jié)果會受到樣品PBMC本身的質(zhì)量的影響較大，如果PBMC分離或者保藏不當(dāng)，很可能會失去功能學(xué)活性，導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。ELISPOT檢測結(jié)果同時受到樣品PBMC本身免疫狀態(tài)影響，如在采集時處于免疫活躍狀態(tài)，會出現(xiàn)較多的背景斑點(diǎn)，檢測結(jié)果得到的斑點(diǎn)數(shù)會是假陰性。因此，為了得到更加真實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行樣品分析時，如圖2所示，對于每一個樣品均會設(shè)置CD3刺激組來監(jiān)控PBMC的功能活性，Medium分組來監(jiān)控PBMC的免疫背景，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行特定抗原的檢測分析。
圖2. ELISPOT樣品分析體系
3. ELISPOT作為最為靈敏的檢測技術(shù)，結(jié)果受到的影響因素較多，樣品進(jìn)行分析時往往會出現(xiàn)異常的數(shù)據(jù)，很多供應(yīng)商只匯報檢測斑點(diǎn)結(jié)果，并不能有效的進(jìn)行數(shù)據(jù)解讀。熙寧生物對于ELISPOT檢測技術(shù)和細(xì)胞免疫具有深刻的理解，基于CD3組的方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)得到了PBMC最小響應(yīng)閾值MIR，基于Medium組的方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)得到最小效應(yīng)限LOD，結(jié)合實(shí)踐情況，會對每一個檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行充分的結(jié)果，，確保數(shù)據(jù)的科學(xué)性和合理性。
在基因治療藥物的臨床生物分析實(shí)踐，細(xì)胞免疫原性檢測有以下關(guān)鍵點(diǎn)：
1. 如圖3展示的T細(xì)胞激活原理，ELISPOT方法學(xué)的靈敏度跟刺激物選擇有關(guān)，通常情況方法的靈敏度的高低排序?yàn)?，含有多肽?fù)合物的抗原遞呈細(xì)胞>多肽>蛋白/病毒顆粒。對于腫瘤疫苗和DC疫苗，由于機(jī)體免疫細(xì)胞對其反應(yīng)比較溫和，建議使用最為靈敏的刺激物。熙寧生物有豐富的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和免疫細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，可進(jìn)行有多肽復(fù)合物的抗原遞呈細(xì)胞的培養(yǎng)和制備，設(shè)計更加復(fù)雜也更加靈敏的ELISPOT檢測方法。
圖3. T細(xì)胞激活原理
2. 在臨床檢測過程中，從全血樣品采集到分離PBMC的中間時間不應(yīng)超過8小時，不然分離出來的的PBMC的功能活性會受到極大影響，造成大部分樣品假陰性的結(jié)果。對于這個在臨床檢測分析的痛點(diǎn)，熙寧生物自主開發(fā)了相應(yīng)的方法，可將全血分離PBMC的穩(wěn)定時間延長至48小時，在保證檢測結(jié)果真實(shí)可靠的前提下，滿足臨床運(yùn)營商，從從臨床中心進(jìn)行樣本采集運(yùn)輸?shù)椒治鰧?shí)驗(yàn)室的可操作性，考察結(jié)果如4所示：
圖4. 熙寧全血穩(wěn)定性測定結(jié)果
細(xì)胞免疫原性評估對象是PBMC，但PBMC由于全血采集后的穩(wěn)定性較差，且免疫背景較為復(fù)雜，使得ELISPOT的檢測結(jié)果的解析變得極為復(fù)雜，甚至很多時候檢測結(jié)果本身也有失真的風(fēng)險。需要基于對方法和作用機(jī)理的充分理解，來保障檢測的順利進(jìn)行。熙寧生物通過合理的樣品分組設(shè)計，方法學(xué)參數(shù)驗(yàn)證確定，會對每一個臨床樣品的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行充分解讀。同時基于臨床試驗(yàn)樣品全血采集后穩(wěn)定性較短的難點(diǎn)，研發(fā)了一款全血穩(wěn)定劑，可將全血采集后的穩(wěn)定時間延長到48小時，在確保樣品穩(wěn)定結(jié)果真實(shí)的情況下盡可能了便利臨床運(yùn)營。
基因治療作為熱門的新興療法，近些年發(fā)展迅速。同時，基因治療藥物研發(fā)需求多樣化、技術(shù)復(fù)雜度高的特點(diǎn)，也對檢測分析帶來巨大挑戰(zhàn)。熙寧生物搭建了基于基因治療藥物檢測需求的基因檢測平臺、細(xì)胞/病毒檢測平臺、流式檢測平臺和免疫檢測平臺等，能夠滿足研發(fā)項目在不同階段的在生物分析需求。團(tuán)隊專注于GCT領(lǐng)域，積累了豐富的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)的技術(shù)服務(wù)能力，通過qPCR/ddPCR技術(shù)、細(xì)胞法中和抗體檢測技術(shù)、ELISPOT細(xì)胞免疫原性檢測技術(shù)、流式檢測技術(shù)、ELISA/MSD檢測技術(shù)等多平臺技術(shù)互聯(lián)，打通技術(shù)隔閡，真正實(shí)現(xiàn)“一個臨床/項目，一個生物分析實(shí)驗(yàn)室，一個技術(shù)項目團(tuán)隊”的服務(wù)方式，為基因治療產(chǎn)品生物分析提供完整解決方案。
