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流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細胞儀對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒同時進行多參數(shù)、快速定量分析和分選的高新技術(shù)，在臨床樣品分析中，可以支持包括免疫分型/淋巴細胞亞群分析、磷酸化/甲基化/泛素化蛋白、受體占位、胞內(nèi)因子、微小殘留病監(jiān)測等多種檢測分析。在淋巴細胞亞群分析中，最普遍常用的指標(biāo)包括對CD3+T淋巴細胞，CD3+CD4+輔助/誘導(dǎo)T淋巴細胞，CD3+CD8+抑制/殺傷T淋巴細胞，CD3-CD19+B淋巴細胞，CD3-(CD16+CD56)+NK淋巴細胞，以及CD3+CD4+CD25+CD127-/low調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）。此外，單核細胞中的CD14+陽性細胞群也會在部分項目中與淋巴細胞亞群相結(jié)合，因此共同分析，即TBMNK。
近期，中國醫(yī)藥質(zhì)量管理協(xié)會醫(yī)學(xué)檢驗質(zhì)量管理專業(yè)委員會發(fā)布了一篇《淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤中應(yīng)用的專家共識》（以下簡稱《共識》），我們歸納總結(jié)了其中的關(guān)鍵要點，結(jié)合熙寧生物|精翰生物在淋巴細胞亞群檢測眾多項目累積的經(jīng)驗，做一個簡要梳理，拋磚引玉，歡迎交流討論。
在淋巴細胞亞群檢測中，TBNK推薦的單抗為CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56，Treg檢測的單抗為CD4、CD25、CD3、CD127。CD3+T細胞標(biāo)記為CD3+，CD4+T細胞標(biāo)記為CD3+CD4+，CD8+T細胞標(biāo)記為 CD3+CD8+，B細胞標(biāo)記為CD3-CD19+，NK細胞標(biāo)記為CD3-(CD16+CD56)+，Treg細胞的標(biāo)記為CD3+CD4+CD25+FoxP3+或CD3+CD4+CD25+CD127-/low。T細胞表面CD127的低表達與T細胞質(zhì)內(nèi)FoxP3的高表達具有良好的相關(guān)性，且以CD127為標(biāo)志進行檢測的方法明顯優(yōu)于以細胞質(zhì)內(nèi)FoxP3為標(biāo)志的檢測方法[1-3]，因此也可以使用CD127替代FoxP3進行Treg細胞的分析。
使用CD25+FoxP3+和CD25+CD127-/low兩種方式標(biāo)記Treg，熙寧生物|精翰生物均具有豐富的項目經(jīng)驗?；谖鯇幧飢精翰生物的項目經(jīng)驗而言，使用CD25+CD127-/low標(biāo)記Treg的方法可在室溫/2-8℃，兩種儲存條件下穩(wěn)定儲存12天（days，下文簡稱“D”）；使用CD25+FoxP3+標(biāo)記Treg的方法可在室溫穩(wěn)定儲存4D，在2-8℃穩(wěn)定儲存5D。綜上，使用CD127替代FoxP3標(biāo)記Treg在方法的穩(wěn)定性方面具有極大的提升，這與《共識》中的結(jié)論也是統(tǒng)一的。熙寧生物|精翰生物使用CD127-/low CD25+標(biāo)記Treg的部分穩(wěn)定性數(shù)據(jù)展示如下：
表1 使用CD127-/low CD25+標(biāo)記Treg的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
注：該方法已經(jīng)過熙寧生物|精翰生物內(nèi)部全驗證，可直接支持樣品分析。“CD127-/lowCD25+%” 為CD127-/lowCD25+占父群的比例，即Treg占CD4+T細胞亞群的比例。A，室溫儲存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，與基線相比%CV范圍為：0.9%-11.2%。B，2-8℃儲存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，與基線相比%CV范圍為：0.3%-10.1%。
淋巴細胞亞群檢測可以通過單平臺法或雙平臺法[4]進行，取樣時，首選乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝真空管采集外周靜脈血標(biāo)本，并在24h內(nèi)進行檢測。送檢時間超過30h應(yīng)該采用肝素鈉或枸櫞酸鈉抗凝，可在室溫下穩(wěn)定保存至48h，若送檢時間超過48h，應(yīng)該使用流式細胞檢測專用的樣本保存液或樣本保存管，可穩(wěn)定保存至14D。熙寧生物|精翰生物已有經(jīng)過全驗證的TBMNK檢測方法，使用特殊采血管進行樣品采集，可直接用于支持臨床樣本中CD3+T淋巴細胞，CD3+CD4+輔助/誘導(dǎo)T淋巴細胞，CD3+CD8+抑制/殺傷T淋巴細胞，CD3-CD19+B淋巴細胞，CD3-CD16+/CD56+NK淋巴細胞占淋巴細胞的比例，和CD14+單核細胞占單核細胞的比例，及各個細胞亞群在外周血中濃度的檢測。已驗證可在室溫/2-8℃，兩種儲存條件下穩(wěn)定儲存14D，部分穩(wěn)定性數(shù)據(jù)展示如下：
表2 人全血中TBMNK穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
注：使用特殊采血管采集的人全血，室溫儲存14天后，與基線相比%CV范圍為0.3%-13.8%。
在健康成年人外周血中，T、B、NK及Treg細胞在今年的多項研究中均有發(fā)布，針對我國不同地區(qū)、年齡等健康人群均提供了相應(yīng)的參考區(qū)間，見下表：
表3 健康成年人外周血TBNK淋巴細胞參考區(qū)間
注：我國九?。ê?、河南、廣東、吉林、山東、山西、江蘇、浙江、四川）20~60歲健康成人TBNK淋巴細胞參考區(qū)間的研究結(jié)果，供參考。
表4 健康成年人外周血Treg細胞參考區(qū)間
血液腫瘤作為造血干細胞異常的惡性腫瘤，疾病的多種因素會影響免疫細胞的產(chǎn)生、增殖及分化，使外周血的淋巴細胞數(shù)量與功能產(chǎn)生異常，導(dǎo)致免疫功能失調(diào)，因此對血液腫瘤患者進行規(guī)范的淋巴細胞亞群檢測十分必要。淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤患者中的應(yīng)用包括以下幾個方面：
1.淋巴細胞亞群分析可以支持部分血液腫瘤的篩查（如急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞增殖性疾病(CLPD)等）
當(dāng)出現(xiàn)以下情況：
① B或NK淋巴細胞顯著增高；
② CD3+CD4+CD8+T淋巴細胞或CD3+CD4-CD8-T淋巴細胞明顯增高；
③ CD4/CD8比值大于10:1或小于1:10；
④ CD3+%+CD19+% +（CD16+CD56）+%明顯大于或小于（100 ± 5）%、CD4+%+CD8+%明顯大于或小于CD3+%（變化范圍為5%~10%）;
在排除標(biāo)本、儀器、設(shè)門、試劑及反應(yīng)性改變等因素后，需要考慮標(biāo)本中存在異常淋巴細胞，并結(jié)合臨床進行血液腫瘤的篩查。血液腫瘤常見的淋巴細胞亞群改變見下圖：
注：A表示T淋巴細胞群比例增高;B表示B淋巴細胞群比例增高;C表示NK細胞群比例增高;D、E表示同一患者T、B、NK三群淋巴細胞比例之和小于95%，存在不表達CD3、CD19、CD16和CD56的淋巴細胞;F表示CD4+T、CD8+T淋巴細胞群比例大致正常;G表示CD4+T淋巴細胞群比例降低，CD8+T淋巴細胞群比例增高;H表示CD4+T淋巴細胞群比例增高，CD8+T淋巴細胞群比例降低:I表示中CD4+CD8+T淋巴細胞群比例增高:J表示 CD4-CD8-T淋巴細胞群比例增高。
血液腫瘤淋巴細胞亞群篩查與隨訪路徑見下圖：
注：MICM表示形體學(xué)、免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)分型
2.腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)警及預(yù)后評估
CD3+、CD4+、CD8+T細胞的數(shù)量和比例與患者的完全緩解（CR）率、無復(fù)發(fā)生存期（RFS）和總生存期（OS）呈正相關(guān)，而Treg的數(shù)量和比例與CR率、RFS和OS呈負相關(guān) [5-9] 。在AML患者中，NK細胞數(shù)量和比例與CR率、RFS、OS呈正相關(guān) [10] 。
3.合并感染風(fēng)險預(yù)警
感染是血液腫瘤患者的常見并發(fā)癥，當(dāng)CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)＜500個/μL時，血液腫瘤患者機會性感染風(fēng)險會大幅升高[11]。初診時Treg細胞比例升高的血液腫瘤患者，其住院期間感染率明顯增加[12]。
4.造血干細胞移植后免疫重建監(jiān)測及GVHD預(yù)防
造血干細胞移植(HSCT)后造血能力持久恢復(fù)與免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為免疫細胞數(shù)量的增加和細胞功能狀態(tài)的恢復(fù)。NK細胞一般移植后2~3周可恢復(fù)，CD3+CD8+T淋巴細胞一般移植后1~3月恢復(fù)，CD3+CD4+T淋巴細胞恢復(fù)通常需要1年以上。CD3-CD19+B淋巴細胞移植后恢復(fù)時間不定，短至3個月，長至1年半以上。Treg細胞在移植早期通常比例非常低，移植晚期逐漸增多。
具有負調(diào)控炎癥反應(yīng)功能的Treg細胞隨GVHD等級的增加呈下降趨勢，有望成為預(yù)測急性GVHD（發(fā)生于移植后100d內(nèi)）和慢性GVHD（發(fā)生于移植100d后）的特異性指標(biāo)[13-14]。因此異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)患者在早期植入階段（輸注后2~4周）、移植后早期階段（輸注后1~3月）、移植后晚期階段（輸注后3月以后）都建議行淋巴細胞亞群檢測。
5.CAR-T治療患者的規(guī)范化管理和評估
定期監(jiān)測CAR-T治療患者體內(nèi)的CAR-T細胞水平、腫瘤負荷、免疫功能（主要包括淋巴細胞亞群的比例和數(shù)量）和相關(guān)不良反應(yīng)（細胞因子釋放綜合征、神經(jīng)毒性等），是治療后病情評估的重要手段[15-16]?；颊呋剌擟AR-T細胞后，可通過FCM監(jiān)測外周血中CAR-T細胞的比例和數(shù)量，有條件的實驗室還可開展熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（qRT-PCR）監(jiān)測CAR-T細胞增殖水平。
淋巴亞群檢測也被推薦與CAR-T細胞監(jiān)測同時進行[16]。有研究通過檢測患者CAR?T細胞回輸后第15天的外周血淋巴細胞水平，發(fā)現(xiàn)低水平的淋巴細胞數(shù)（<0.67×109/L）是患者的不良預(yù)后因素，顯著影響病情緩解[17]。有研究者提出，具有中央記憶T細胞和干細胞樣記憶T細胞表型的CAR-T細胞，在體內(nèi)有更強的增殖能力及更持久的抗腫瘤效應(yīng)[18-19]。對于CAR-T細胞治療的患者，有條件的情況下，可以進行CAR-T細胞的精細亞群分析和長期隨訪。
6.血液腫瘤患者藥物治療指導(dǎo)
對于靶向治療B-NHL的CD20單抗，B細胞是否完全清除可以用于評估CD20單抗的治療反應(yīng)和療效[20-22]。對于免疫功能嚴重受損的患者（經(jīng)過放化療治療或合并HIV感染等），患者在治療過程中嚴重感染的頻率顯著增加，建議根據(jù)患者的CD4+T細胞數(shù)量制定治療策略；對于移植及個體化免疫治療患者，則可以參考CD4+/CD8+細胞比值；對于治療期間合并感染的患者，更需要關(guān)注NK細胞或者CD8+T細胞。
7.動態(tài)監(jiān)測與隨訪時機的選擇
健康人群的參考區(qū)間可能不能有效評估血液腫瘤患者的免疫功能，建議建立患者個體化的淋巴細胞亞群檢測結(jié)果的基線，并規(guī)律、動態(tài)的監(jiān)測其變化趨勢。血液腫瘤患者常伴有免疫功能失衡，初診時檢測患者的淋巴細胞亞群，有助于判斷免疫功能的初始狀態(tài)。放化療、免疫治療及靶向治療期間患者可呈周期性改變，檢測淋巴細胞亞群變化可用于評估患者治療期間免疫功能恢復(fù)情況及腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險。建議在治療結(jié)束后半年內(nèi)每3個月跟蹤檢測，半年后每6個月進行隨訪。造血干細胞移植后患者在移植后第14天、第21天、1個月、2個月、3個月、6個月、1年、2年隨訪建議檢測淋巴細胞亞群。建議連續(xù)監(jiān)測患者CAR-T細胞回輸前1天、回輸后第4天、第7天、第14天、第28天外周血淋巴細胞亞群變化情況，及治療后2個月、3個月、6個月隨訪，見下圖：
血液腫瘤淋巴細胞亞群檢測路徑圖
淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤中具有重要的臨床意義和廣泛的應(yīng)用前景，通過TBNK、Treg這些指標(biāo)，可以評估血液腫瘤患者免疫狀況，為疾病診斷、分型，治療方案的選擇、化療后感染預(yù)防，疾病轉(zhuǎn)歸等提供實驗室依據(jù)，以及為血液腫瘤患者的個性化治療提供參考。
熙寧生物 | 精翰生物流式團隊由30余名經(jīng)驗豐富的人員組成，配備BD流式細胞儀、Beckman流式細胞儀、Cytek光譜流式細胞儀等儀器和設(shè)備，支持過包括抗體類藥物、基因與細胞治療藥物、小分子創(chuàng)新藥等各類新藥的流式分析檢測，其中抗體藥物>20個，基因與細胞治療藥物>10 個，小分子創(chuàng)新藥>10 個，臨床試驗>40 個，更是支持國內(nèi)第一款I(lǐng) 類新藥的CAR-T產(chǎn)品- 藥明巨諾倍諾達?（瑞基奧侖賽注射液）的樣本檢測分析工作。平臺能夠支持包括免疫細胞亞群分型檢測，細胞治療產(chǎn)品的PK/PD 分析，抗體藥物的受體占位分析，PD指標(biāo)蛋白磷酸化、甲基化、乙?；瘷z測，胞內(nèi)因子檢測等。尤其在血液腫瘤淋巴細胞亞群檢測中具有大量的實戰(zhàn)經(jīng)驗，歡迎咨詢溝通。
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