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近些年腫瘤免疫療法迅速發(fā)展，諸如CART、TIL、雙抗等高效的免疫療法在臨床試驗(yàn)中已展現(xiàn)出明顯的腫瘤殺傷和臨床有效性，其中一些藥物已經(jīng)獲批上市，許多患者因此受益，生命得到延續(xù)。在這些藥物研究的過程中，細(xì)胞因子釋放綜合征作為一種常見的免疫治療不良反應(yīng)事件受到廣泛關(guān)注。
細(xì)胞因子屬于小分子蛋白質(zhì)，對細(xì)胞間的相互作用及信號傳導(dǎo)有影響。細(xì)胞因子包括淋巴因子、單核細(xì)胞因子、趨化因子、白介素等，既有促炎細(xì)胞因子也有抗炎細(xì)胞因子。有些細(xì)胞因子在適量情況下可以起到抑制腫瘤的作用，例如NK細(xì)胞受刺激后通過穿孔素/顆粒酶通路或凋亡誘導(dǎo)配體溶解腫瘤，分泌干擾素-γ，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)抗原呈遞，抑制血管生成。免疫細(xì)胞在抵抗外來入侵或清除異常時會釋放大量促炎因子（如干擾素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等）。當(dāng)免疫系統(tǒng)獲得勝利后，便會減少細(xì)胞因子的釋放，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。然而，在進(jìn)行免疫治療時，如果免疫系統(tǒng)過度激活，便會產(chǎn)生過多的細(xì)胞因子，引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴。細(xì)胞因子風(fēng)暴又稱為細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS），是一種常見的免疫治療并發(fā)癥，盡管這種不良反應(yīng)發(fā)生率比較低，但CRS一旦發(fā)生就會引發(fā)全身的炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時可能危及生命。
目前臨床上最常見的細(xì)胞因子風(fēng)暴檢測指標(biāo)包括IL-6、TNF-α、IFN-γ等，可以通過多因子組合進(jìn)行檢測以節(jié)省樣本體積和檢測成本，提高檢測效率。
細(xì)胞因子屬于生物標(biāo)志物的范疇，由于生物標(biāo)志物的復(fù)雜性，目前還沒有明確的方法驗(yàn)證指南文件。2018年版FDA發(fā)布的BMV指南中提到：當(dāng)生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)用于支持監(jiān)管決策時，例如用于藥物安全性和/或有效性的重要決定，或用于支持藥物標(biāo)簽中的劑量說明時，其分析方法應(yīng)得到充分驗(yàn)證。但同時，對于生物標(biāo)志物的方法學(xué)做到何種程度，建議基于fit for purpose原則來確定。例如：對于用于支持監(jiān)管決策的指標(biāo)，應(yīng)進(jìn)行完整驗(yàn)證，對于探索性指標(biāo)，進(jìn)行部分驗(yàn)證或方法測試。
方法的完整驗(yàn)證參考PK的驗(yàn)證要求，完整驗(yàn)證包括至少準(zhǔn)確度和精密度、平行性、基質(zhì)效應(yīng)、稀釋線性和穩(wěn)定性。
由于大多數(shù)生物標(biāo)志物在基質(zhì)中有一定的內(nèi)源性水平，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常配制在緩沖液或替代基質(zhì)中，如果可以篩選到足夠的幾乎不含內(nèi)源性生物標(biāo)志物的基質(zhì)，也可以采取和PK相同的方式進(jìn)行方法學(xué)。
質(zhì)控樣品應(yīng)使用基質(zhì)來制備，優(yōu)先選擇合適內(nèi)源性水平的基質(zhì)作為各濃度水平的質(zhì)控樣品（ULOQ、HQC、MQC、LQC、LLOQ），如果沒有合適的內(nèi)源性基質(zhì)，可在基質(zhì)中加入適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來制備。
對于多因子檢測方法，由于同一個體基質(zhì)中不同因子的濃度水平可能會有較大差異，對于難以協(xié)調(diào)的因子，可以單獨(dú)設(shè)置其質(zhì)控樣品。
準(zhǔn)確度和精密度
準(zhǔn)確度和精密度的考察將通過6個分析批進(jìn)行，每個分析批包含一套標(biāo)準(zhǔn)曲線和三套五個水平的質(zhì)控樣品，用所有質(zhì)控樣品的濃度數(shù)據(jù)計(jì)算批內(nèi)和批間的準(zhǔn)確度和精密度。
各濃度水平的質(zhì)控樣品濃度可以在方法驗(yàn)證前采用至少三個分析批測定后取平均值來確定，也可以在方法驗(yàn)證期間的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)中確定。
平行性
由于生物標(biāo)志物所使用的重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品是一種替代參照品，和內(nèi)源性待測物并不完全一樣，所以生物標(biāo)志物的平行性考察尤為重要。平行性考察可以告訴我們替代標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)源性待測物在檢測方法中的表現(xiàn)是否一致。通過將純基質(zhì)的樣品使用和配制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品相同的稀釋液進(jìn)行序列稀釋，不同稀釋度的樣品乘以稀釋倍數(shù)后濃度之間的%CV在30%以內(nèi)，則平行性考察通過。
選擇性
選擇性，也可以稱為基質(zhì)效應(yīng)，可通過在個體基質(zhì)中分別加入高濃度和低濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行考察，需要注意在計(jì)算回收率時要將內(nèi)源性水平考慮進(jìn)去。另一種方式是加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行序列稀釋，以第一濃度點(diǎn)作為參考值計(jì)算后續(xù)稀釋樣品點(diǎn)的偏差，也就是說當(dāng)不同稀釋度的樣品點(diǎn)在乘以稀釋倍數(shù)后得到的濃度值接近時，就說明含不同比例的基質(zhì)對檢測沒有影響，就可以認(rèn)為無基質(zhì)效應(yīng)。
稀釋線性
如果預(yù)期將來的樣品會產(chǎn)生高于定量上限的濃度，則需要證明稀釋線性。稀釋線性的考查方式和平行性類似，區(qū)別在于稀釋線性需要根據(jù)將來樣品的預(yù)期能達(dá)到的最高濃度配制加標(biāo)樣品，使用該高濃度加標(biāo)樣品作為起始樣品進(jìn)行稀釋后考察。在樣品預(yù)計(jì)的稀釋倍數(shù)不高于平行性中評估的稀釋倍數(shù)時，也可以基于平行性測試對稀釋線性進(jìn)行評估。
穩(wěn)定性
穩(wěn)定性包含室溫、2-8℃、凍融及長期穩(wěn)定性。不同于PK方法，生物標(biāo)志物的穩(wěn)定性以基線測定濃度作為參考值進(jìn)行處理后樣品的評估。
熙寧生物|精翰生物積累了大量的細(xì)胞因子檢測經(jīng)驗(yàn)，對于常見的細(xì)胞因子已開發(fā)相應(yīng)的自主產(chǎn)權(quán)方法學(xué)，如7因子方法學(xué)(IL-2、LI-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、TNF-α)，10因子方法學(xué)等，可用于細(xì)胞因子釋放及臨床樣本的檢測，為申辦方節(jié)省方法學(xué)建立的時間和費(fèi)用成本。同時生物標(biāo)志物平臺目前已具備全面覆蓋不同樣本的檢測能力，從組織、細(xì)胞、蛋白、基因分子各個維度都可以提供相應(yīng)的檢測方案，歡迎各位交流咨詢。
已有生物標(biāo)志物自主產(chǎn)權(quán)方法(部分)
