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熙寧小課-第109期 | GLP-1藥物的臨床生物分析
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時(shí)間:2023-07-12


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最近GLP-1領(lǐng)域捷報(bào)頻傳,諾和諾德司美格魯肽注射液新適應(yīng)癥在國內(nèi)申報(bào)上市,禮來的GCGR/GIPR/GLP-1R三重激動劑Retatrutide在48周治療時(shí)間內(nèi)幫助肥胖者體重減輕了24.2%。作為降糖與減肥領(lǐng)域的熱門靶點(diǎn),GLP-1一直保持著市場熱度,引得國內(nèi)外各大制藥公司競相布局。


GLP-1即胰高血糖素樣肽,屬于腸促胰島素家族,以葡萄糖濃度依賴性方式促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素,參與機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。人體分泌的GLP-1半衰期很短,僅為1~2分鐘,分泌到血液循環(huán)后易被二肽基肽酶4(DPP-4)快速降解而失去促胰島素分泌的活性。GLP-1可減緩胃排空,還可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)上的受體,從而降低食欲,最終起到降低血糖與體重的作用。此外,GLP-1藥物在非酒精性脂肪肝、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面也具有潛在的治療價(jià)值。

圖1 GLP-1作用示意圖

為了充分發(fā)揮GLP-1的藥效,藥物研發(fā)人員在天然GLP-1的基礎(chǔ)上進(jìn)行相關(guān)改造,使其能夠耐DPP-4酶降解,延長其腸促胰島素活性,減少藥物使用的頻率。






GLP-1藥物臨床生物分析策略


在藥物的臨床試驗(yàn)過程中,PK、ADA、NAb是生物制品生物分析中的關(guān)注點(diǎn),GLP-1藥物也不例外,下面筆者將結(jié)合自身的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn),一一來闡述其中的關(guān)鍵點(diǎn)。


  PK


由于GLP-1的作用靶點(diǎn)是細(xì)胞膜上的GLP-1R,GLP-1R屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,它的典型特征是具有一個七次跨膜的結(jié)構(gòu)域,這使得重組表達(dá)的GLP-1R很難保持和GLP-1的高親和力,難以作為靶蛋白應(yīng)用到GLP-1的檢測實(shí)驗(yàn)中。GLP-1結(jié)構(gòu)類似藥物的PK通常選擇雙抗夾心的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)。

GLP-1融合蛋白作為激動劑藥物,臨床用藥劑量相對較低,靈敏度要求通常在幾ng/mL,可使用定制的抗體對或商品化抗體實(shí)現(xiàn)PK濃度的檢測。


  ADA 


可采用橋聯(lián)法來設(shè)計(jì)ADA檢測模式,為了改善藥物耐受,采用酸化解離樣品后經(jīng)固相包被藥物的載體捕獲ADA,然后將ADA酸洗脫下來的方式進(jìn)行樣品純化后檢測。純化后的樣品也可采取物理吸附的方式結(jié)合到分析板上,然后用標(biāo)記的藥物作為檢測試劑進(jìn)行檢測。

圖2 ADA檢測原理示意圖


GLP-1融合蛋白藥物屬于內(nèi)源性GLP-1的類似物,在ADA檢測中除了常規(guī)的篩選→確證→滴度三層級檢測外,還需對在確證實(shí)驗(yàn)中檢測為陽性的樣品進(jìn)行內(nèi)源性GLP-1交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn),以了解抗藥抗體是否有影響內(nèi)源性GLP-1的風(fēng)險(xiǎn)。


  NAb 


基于藥物的作用機(jī)理,GLP-1類藥物的中和抗體分析應(yīng)采用細(xì)胞法。

功能細(xì)胞株高表達(dá)GLP-1R,GLP-1的結(jié)合使細(xì)胞活化,胞內(nèi)cAMP 濃度上升,通過下游信號通路,激活熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄,在加入底物后產(chǎn)生化學(xué)信號。當(dāng)中和抗體存在時(shí)會阻礙藥物和細(xì)胞上的GLP-1R結(jié)合,抑制細(xì)胞的活化,表現(xiàn)為信號降低。

圖3 中和抗體檢測原理示意圖



熙寧生物|精翰生物有自主知識產(chǎn)權(quán)的GLP-1R,GCGR和GIPR報(bào)告基因功能學(xué)細(xì)胞株,具備>50倍以上的信噪比,人血清耐受性和特異性,具備穩(wěn)定的方法學(xué)性能,可服務(wù)于臨床中和抗體檢測,臨床前藥物篩選和CMC放行,功能細(xì)胞株部分活性數(shù)據(jù)如下:


 GLP-1R報(bào)告基因細(xì)胞株數(shù)據(jù):


Dulaglutide的劑量權(quán)限,結(jié)果顯示GLP-1R報(bào)告基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株復(fù)孔間信號CV非常小,有明顯的上下劑量曲線平臺期,信號窗口S/N為118。

Dulaglutide中和抗體有明顯的抑制Dulaglutide刺激GLP-1R報(bào)告基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的作用,中和抑制曲線明顯,中和抗體的靈敏度約為150ng/mL,方法學(xué)靈敏。


 GIPR報(bào)告基因細(xì)胞株數(shù)據(jù):


標(biāo)準(zhǔn)品為Gastric Inhibitory Peptide (GIP)。結(jié)果顯示,含20%混合人血清的反應(yīng)體系,其基質(zhì)效應(yīng)明顯高于含5%和10%混合人血清的反應(yīng)體系。而含5%和10%混合血清的反應(yīng)體系結(jié)果相差不大。


標(biāo)準(zhǔn)品為Gastric Inhibitory Peptide (GIP),對照品為Liraglutide, Human Glucagon(1-29)和Dulaglutide。結(jié)果顯示,Liraglutide, Glucagon(1-29), Human和Dulaglutide沒有非特異信號產(chǎn)生,特異性良好。


 GCGR報(bào)告基因細(xì)胞株數(shù)據(jù):



標(biāo)準(zhǔn)品為Glucagon(1-29),Human。結(jié)果顯示GLP-1R報(bào)告基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株復(fù)孔間信號CV非常小,有明顯的劑量依賴信號響應(yīng),信號窗口S/N大于100倍。

Glucagon作為刺激劑, Hu1803-9D標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度稀釋加入體系中。結(jié)果顯示,Hu1803-9D對Glucagon的抑制作用隨Hu1803-9D濃度升高而增大,且在含有5%混合人血清的環(huán)境中與培養(yǎng)基組沒有明顯差異。

熙寧生物|精翰生物已為多種GLP-1類藥物提供一站式生物分析服務(wù),包括PK,ADA,Nab等,類型覆蓋GLP-1,GIP和GCGR類似物及多功能蛋白,具備豐富的方法學(xué)開發(fā)和樣本檢測經(jīng)驗(yàn),歡迎后臺留言咨詢交流。

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