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前言
細胞因子是一類維持機體自身免疫系統(tǒng)穩(wěn)定并調(diào)控生理病理過程的重要因子，不同的細胞因子在體內(nèi)會形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，若調(diào)控出現(xiàn)失衡，則有可能出現(xiàn)多種疾病。對細胞因子的檢測和及時的動態(tài)監(jiān)測可以幫助及早發(fā)現(xiàn)、診斷、對癥治療相關(guān)疾病，也是個性化治療、精準醫(yī)療、合理用藥的重要內(nèi)容。
細胞因子的定義和功能特點
細胞因子是由免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導(dǎo)免疫細胞以及一些非免疫細胞合成分泌產(chǎn)生的分子量相對較低的可溶性蛋白質(zhì)，分子量通常在6-70kD，大多數(shù)在15-30kD之間。
從功能上來說，細胞因子能在細胞間傳遞信息，通過結(jié)合細胞表面的相應(yīng)受體而發(fā)揮生物學作用?？傮w而言，其生物學活性十分廣泛，參與人體多種重要的生理功能，例如調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細胞生成、細胞生長、損傷組織修復(fù)等。
從作用特點上來說，細胞因子通常是由抗原等刺激物激活相關(guān)細胞才合成和分泌，其合成和分泌的過程也是一種自我調(diào)控的過程，在刺激后會迅速合成，并立即分泌至細胞外從而發(fā)揮生物學作用，后續(xù)也會被迅速降解。刺激消失后合成會很快停止，也就是說，總體而言，細胞因子作用的窗口期短，半衰期短，敏感性強。在體內(nèi)，細胞因子主要是以非特異性的方式來發(fā)揮作用，會形成非常復(fù)雜的多相性網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，比如多效性、重疊性、協(xié)同性、拮抗性等。
細胞因子檢測的意義
作為多種疾病的生物標志物，細胞因子的檢測在很多疾病領(lǐng)域都有重要的意義，尤其是在感染類疾病、惡性腫瘤和自身免疫類疾病上。在感染類疾病中，細胞因子可以用于診斷早期感染、膿毒癥的快速篩查、呼吸機相關(guān)性肺炎的篩查、鑒別G-/G+菌感染、評估病毒感染患者的病情嚴重程度等。惡性腫瘤方面，細胞因子可以用于評估腫瘤微環(huán)境進展，輔助腫瘤早期診斷、預(yù)測免疫治療療效以及化療和手術(shù)的預(yù)后預(yù)測等。在自身免疫性疾病上，細胞因子在噬血細胞綜合癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、過敏性紫癜、自身免疫性肝炎等疾病上均有應(yīng)用。
除了上述三個疾病領(lǐng)域以外，細胞因子的檢測在其它領(lǐng)域也有很多的應(yīng)用，比如輔助篩查流產(chǎn)病因，監(jiān)測移植排斥與免疫、指導(dǎo)臨床激素和抗炎藥的應(yīng)用，在重癥急性胰腺炎、氣道炎癥、燒傷、以及醫(yī)美領(lǐng)域的應(yīng)用等等。
另外值得單獨一提的和細胞因子相關(guān)的就是細胞因子風暴，膿毒癥、重癥感染、噬血細胞綜合征、腫瘤免疫治療、罕見變異病毒感染或大手術(shù)患者均可引起細胞因子風暴。監(jiān)測細胞因子可以為及時治療和預(yù)警細胞因子風暴風險，幫助區(qū)分細胞因子風暴的免疫狀態(tài)提供很大的幫助，提高患者治療的有效率。在CDE發(fā)布的藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則中，也有對免疫調(diào)節(jié)類藥物進行細胞因子釋放實驗的要求，以提前對免疫調(diào)節(jié)類藥物造成的細胞因子釋放風險進行考察。
細胞因子檢測的影響因素和難點
靈敏度要求高
大部分的細胞因子在體內(nèi)的含量是非常低的，通常在pg/mL的水平上，正常人有時甚至會在fg/mL的水平上，例如IL-2，IL-4。患者體內(nèi)的細胞因子濃度可能會有所增加，不同的疾病類型，細胞因子的濃度差別也很大。在進行檢測方法的開發(fā)時，我們需要基于分析目的和人群的細胞因子濃度分布來確定方法的靈敏度。由于靈敏度的高要求，對于細胞因子檢測的檢測試劑，主要是細胞因子的檢測抗體的親和力要求還是很高的，使用親和力低的抗體往往達不到目標靈敏度。
缺少標準化的檢測方法
總體而言，細胞因子的方法也是使用重組蛋白進行的相對定量方法，不管是自建的還是商業(yè)化的試劑盒，在方法性能上，不同的方法差異很大，比如方法的重現(xiàn)性、準確度和精密度、關(guān)鍵試劑變更或者條件變更時的穩(wěn)固性等。參照品的選擇在不同的方法也很不相同，所以對于細胞因子的方法，不同方法間檢測結(jié)果的差異往往也很難對比，也就是很難有一個統(tǒng)一標準化的檢測方法，這個也是目前細胞因子檢測上經(jīng)常遇到的問題，例如在IL-10的檢測項目上，不同的試劑盒檢測出來的結(jié)果有的在0點幾到幾pg/mL之間，有的在幾十pg/mL，還有的在幾百pg/mL，甚至是同一個廠商的不同貨號的試劑盒，結(jié)果差異有時也很大。所以在選擇細胞因子的試劑盒時，也不能僅僅只關(guān)注靈敏度的數(shù)值，關(guān)注細胞因子方法的樣品檢出率會更有意義。
基質(zhì)的影響和干擾
從影響細胞因子定量結(jié)果的因素上來說，除了分析方法的差異，細胞因子在基質(zhì)環(huán)境中受到的干擾也對結(jié)果有很大的影響。例如可以和細胞因子結(jié)合的蛋白、抑制劑和可溶性的細胞因子受體，也是我們在方法開發(fā)的時候需要關(guān)注的重點。對于一些特殊的細胞因子，在檢測試劑的選擇上還要有特殊的考量，以區(qū)分基質(zhì)中存在的類似結(jié)構(gòu)的其他物質(zhì)。
一些生物基質(zhì)中的干擾物質(zhì)也可以和檢測的試劑結(jié)合產(chǎn)生假陽性的信號，比如類風濕因子、異嗜性抗體、補體等等。在方法開發(fā)時也要選擇合適的稀釋液和檢測試劑以消除或減輕這些干擾。另外，生物樣本的處理過程也可能會對結(jié)果有影響，不同的基質(zhì)中細胞因子的濃度也往往會有差異。例如TGFβ1、VEGF、TNFα等，在不少文獻中都有報道，在血清和血漿中檢測出的濃度是不同的，很可能是由于凝血過程中血小板活化釋放導(dǎo)致。
細胞因子的檢測平臺
在細胞因子的檢測平臺上，主要是以體外檢測的平臺為主，當然目前也有一些基于生物傳感裝置的體內(nèi)檢測平臺，但大多都還是在較為早期的研究階段。
從主要的體外檢測平臺來說，ELISA、MSD、Luminex、流式、Simoa應(yīng)用的較為廣泛，每個平臺也有他自身的優(yōu)勢。ELISA的成本低，可選擇的商業(yè)化試劑盒多，平臺的普及度高。MSD平臺靈敏度高，線性范圍寬，而且可以多組分同時檢測，樣品用量小。Luminex的靈活性最高，例如Luminex 200理論上最多可以同時檢測100種組分。流式的優(yōu)勢是可以對胞內(nèi)的細胞因子濃度進行檢測，而且也可以多組分檢測。Simoa平臺則是所有平臺中靈敏度最高的，可以定量檢測fg/mL水平的細胞因子。
從臨床檢測上來說，目前更多的項目在細胞因子的檢測上會優(yōu)先考慮一些多因子的檢測平臺，這個也是由于疾病發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性，單一生物標志物很可能不能充分反應(yīng)疾病的狀態(tài)，對于多個細胞因子均采用單獨檢測的方式的成本會很高，對樣品量的要求也很大，所以多因子的檢測平臺會更有優(yōu)勢。目前最主要的多因子檢測平臺是Luminex和MSD，在靈活組合的同時也可以保證一定的檢測靈敏度。
細胞因子方法開發(fā)考察項
對于細胞因子的方法而言，最主要的一些考察項包括標準曲線、個體基質(zhì)濃度分布、平行性和選擇性、方法的特異性、QC定值、準確度和精密度、稀釋線性和鉤狀效應(yīng)、穩(wěn)固性和穩(wěn)定性。對于不同的分析目的，考察項的側(cè)重也可以有所不同。要求比較高的全驗證的方法，通常是作為提交監(jiān)管申報的數(shù)據(jù)檢測方法，需要盡可能考察的全面一些，對于探索性的目的，則可以從成本出發(fā)，主要關(guān)注方法的一些關(guān)鍵項，比如平行性、選擇性、準確度和精密度、穩(wěn)定性。平行性是判斷方法基質(zhì)效應(yīng)的關(guān)鍵，不過很多細胞因子由于內(nèi)源性濃度太低，在方法學階段無法進行平行性測試，可以先使用選擇性的測試來進行。對于稀釋線性和鉤狀效應(yīng)的考察，也可以基于內(nèi)源性的濃度預(yù)測來判斷是否有考察的必要。另外，基于成本的考慮，QC定值也可以采取不同的策略，例如和準確度精密度分析批同時進行。
熙寧|精翰生物自主研發(fā)的細胞因子方法
熙寧|精翰生物在主流的細胞因子檢測平臺(ELISA、MSD、Luminex、流式、Simoa等)均有布局，積累了大量的細胞因子檢測經(jīng)驗，對于常見的細胞因子也已開發(fā)相應(yīng)的自主產(chǎn)權(quán)方法，例如熙寧生物自主研發(fā)的7因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、TNFα)方法學，可用于細胞因子釋放實驗及臨床血清樣品的檢測，可以為申辦方省去方法學建立的時間，并大大減少方法學和后續(xù)檢測的試劑成本。
熙寧生物已有生物標志物自主產(chǎn)權(quán)方法（部分）
參考文獻
[1] H. Kulbe, P. Chakravarty, D. A. Leinster, K. A. Charles, J. Kwong, R. G.Thompson, J. Coward, T. Schioppa, S. C. Robinson,W. M. Gallagher, Cancer Res. 2012, 72, 66.
[2] P. Mehta, D. F. McAuley, M. Brown, E. Sanchez, R. S. Tattersall, J. J.Manson, Lancet 2020, 395, 1033.
[3] J. B. Moore, C.H. June, Science 2020, 368, 473.
[4] S. Simpson, J. Kaislasuo, S. Guller, L. Pal, Cytokine 2020, 125, 154829.
[5] X. Zhou, M. S. Fragala, J. E. Mcelhaney, G. A. Kuchel, Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 2010, 13, 541.
