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PART 01
什么是外顯子？
基因組(Genome)指一個生物體所包含DNA的全部遺傳信息，人類的基因組大小約為30億個堿基對(3Gb)?；蚪M由編碼區(qū)域(Coding Region)和非編碼區(qū)域(Non-coding Region)組成，其中非編碼區(qū)域占絕大多數(shù)。真核生物的編碼區(qū)是不連續(xù)的，包含外顯子(Exon)和內(nèi)含子(Intron)。在轉(zhuǎn)錄過程中會剪切內(nèi)含子，并拼接外顯子形成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并最終翻譯成蛋白質(zhì)。外顯子組(Exome)是基因組中所有外顯子的集合，是基因組中能夠轉(zhuǎn)錄出成熟RNA的部分。人類擁有約18萬個外顯子，約占人類基因組的1%，即約3000萬個堿基對(30Mb)。
圖1 基因外顯子和內(nèi)含子示意圖
蛋白質(zhì)編碼基因翻譯成有功能的蛋白，需要從DNA轉(zhuǎn)錄為RNA前體(pre-RNA)，進而通過剪接形成成熟RNA(mRNA)，成熟RNA序列翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸鏈。在mRNA的兩側(cè)分別存在5'UTR和3'UTR，它們的作用是調(diào)控翻譯的啟動和終止。雖然它們由外顯子序列構(gòu)成，但是不會被翻譯成氨基酸。 所以并非所有外顯子序列都會被翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
圖2 pre-mRNA剪接形成成熟mRNA
PART 02
什么是外顯子組測序？
對基因組里所有的外顯子進行測序即為全外顯子組測序(Whole Exome Sequencing，WES)，由于全外顯子序列較長，通常使用高通量測序，即二代測序(Next-generation Sequencing，NGS)的方法實現(xiàn)。雖然WES所占基因組比例1%，但包含了約85%與疾病有關(guān)的變異。因此相比于全基因組測序(Whole Genome Sequencing，WGS)，WES能夠減少測序費用的同時提高測序深度，從而以更低的成本檢測到更多的低頻變異，所以WES是比WGS更為經(jīng)濟高效的替代方法。相比于靶向測序（通常覆蓋<1000個基因），隨著新的疾病及其分子機制被不斷揭示，需要加入檢測列表的基因會越來越多，因此固定基因的靶向測序無法及時滿足多樣性的需求。WES覆蓋范圍更廣闊，理論上可以對腫瘤和遺傳疾病等所有的疾病類型進行研究。
圖3 高通量測序儀外顯子組測序
PART 03
外顯子組測序在藥物研發(fā)中的應(yīng)用
靶向藥物患者入組檢測及生物標志物探索
通過WES測序，可以獲得點突變、小片段插入或缺失、拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異等信息。由于包含所有基因的外顯子，WES測序全面覆蓋靶向用藥的相關(guān)位點，可以提供全面的用藥指導(dǎo)和耐藥信息。WES測序的檢測結(jié)果，可以針對藥物靶標位點幫助藥企在藥物開發(fā)中篩選入組患者。同時，豐富的檢測數(shù)據(jù)可以幫助藥企進行潛在生物標志物的探索，縮短藥物研發(fā)周期，提升藥物研發(fā)效率。
以PARP抑制劑為例，同源重組修復(fù)缺陷(Homologous Recombination Deficiency，HRD)是描述同源重組修復(fù)( Homologous Recombination Repair，HRR)信號通路核心基因BRCA1/2突變、其他基因突變、啟動子甲基化，乃至一些不明機制導(dǎo)致的患者無法通過精確的同源重組通路來修復(fù)DNA雙鏈斷裂的狀態(tài)，臨床表現(xiàn)為對PARP抑制劑高度敏感?；赪ES覆蓋全的特點，同時結(jié)合中國人群相關(guān)的用于評估染色體結(jié)構(gòu)變異程度的SNPs，以此為基礎(chǔ)建立的HRD檢測策略，可精細評估腫瘤樣本中發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)變異的程度，準確檢測具有HRD特征的“基因組瘢痕”標記，為HRD整體評估提供參考依據(jù)。HRD檢測被用于指導(dǎo)卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等癌癥患者選擇最佳的治療方案，特別是指導(dǎo)PARP抑制劑的使用。
圖4 HRD檢測提升PARP抑制劑獲益人群
腫瘤免疫治療療效預(yù)測的生物標志物
免疫治療已在多種腫瘤的治療中顯示出有效性和安全性，并被廣泛應(yīng)用，然而，并不是所有患者都能從免疫治療中獲益，因此需要借助特定的生物標志物來篩選適宜人群和預(yù)測免疫治療的療效。腫瘤突變負荷(Tumor Mutational Burden，TMB)是指腫瘤基因組外顯子區(qū)域內(nèi)每百萬堿基存在的體細胞非同義突變位點數(shù)量，可以間接反應(yīng)腫瘤產(chǎn)生新生抗原的能力。已有多項臨床研究證實，腫瘤突變負荷高的患者，更可能從免疫檢查點抑制劑(Immune Checkpoint Inhibitor，ICI)治療中獲益。全外顯子組測序?qū)θ嘶蚪M上全部的外顯子進行測序，能夠全面檢測外顯子上的突變信息，是行業(yè)內(nèi)公認的TMB檢測的金標準。今年10月12日，國內(nèi)首個獲批的NGS大Panel IVD產(chǎn)品的TMB性能評估就以WES檢測作為金標準對比方法，這足以證明WES檢測的重要性。
WES檢測除了能反映TMB的情況，還包括數(shù)個其他與免疫治療療效相關(guān)的指標，包括全面的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability，MSI)和錯配基因損傷修復(fù)(Mismatch Repair， MMR)等信息，因此通過WES測序可以多維度預(yù)測免疫治療療效。
圖5 PD-1/PD-L1抑制劑作用機制
提供個性化疫苗相關(guān)新生抗原
腫瘤新生抗原(Neoantigen)是源于腫瘤細胞中的突變基因的表達，是一類腫瘤特異性抗原，并不存在于正常的組織器官當(dāng)中。通過對腫瘤樣本和配對樣本進行全外顯子組測序，結(jié)合改進的生物信息學(xué)工具，通過計算樣本的突變移碼、剪接變體、基因融合、基因表達等變異，就可以預(yù)測所編碼的突變肽與樣本的MHC的結(jié)合親和力，最終得到候選的新生抗原，從而為構(gòu)建腫瘤患者特異性的腫瘤疫苗，再注射進患者體內(nèi)以達到抑制和殺死腫瘤的目的。同時也可以聯(lián)合免疫檢查點抑制劑等療法使用以達到腫瘤治療最優(yōu)化。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤新抗原疫苗可以應(yīng)用于廣泛的癌癥類型，包括黑色素瘤、乳腺癌及肺癌等癌種，使用ICIs或化療聯(lián)合疫苗的療法也可能會更加普遍。
圖6 腫瘤新生抗原疫苗研發(fā)流程
WES檢測輔助實體瘤個性化MRD動態(tài)監(jiān)測
對腫瘤的復(fù)發(fā)進行及時和準確的監(jiān)控并采取干預(yù)措施，是延長腫瘤患者生存期的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的影像學(xué)和蛋白標志物有發(fā)現(xiàn)滯后和準確性低等等弊端?；赾tDNA的實體瘤MRD動態(tài)監(jiān)控具有更高的敏感性和特異性，多項研究均發(fā)現(xiàn)個性化MRD動態(tài)監(jiān)測可以提前幾個月甚至一年于影像學(xué)提示復(fù)發(fā)。MRD通常先對腫瘤組織樣本進行全外顯子組測序，接著基于測序發(fā)現(xiàn)的變異，篩選出腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中一直存在的變異位點，為每一位患者定制個性化監(jiān)控Panel，用于后續(xù)不同隨訪時間點血漿樣本的動態(tài)監(jiān)控。
在藥物研發(fā)中，實體瘤MRD可以輔助篩選用藥獲益的患者，對治療效果進行監(jiān)控，或作為臨床治療的替代終點。IMvigor010是羅氏制藥主導(dǎo)的一項全球性多中心隨機III期臨床試驗，旨在評估阿替利珠單抗在肌層浸潤性尿路上皮癌輔助治療中的作用。前期的分析結(jié)果顯示，研究沒有達到主要研究終點，阿替利珠單抗輔助治療不能顯著延長肌層浸潤性尿路上皮癌患者無病生存時間。然而，隨后采用常規(guī)生物標志物，如PD-L1表達為患者分層的研究，同樣未能顯示阿替利珠單抗的臨床獲益[1]。當(dāng)研究引入個性化MRD動態(tài)監(jiān)測后，發(fā)現(xiàn)阿替珠單抗輔助治療能夠提高MRD陽性患者的DFS，MRD陰性的患者無需阿替珠單抗輔助治療[2]。這項研究結(jié)果說明個性化MRD檢測準確篩選出了藥物獲益的人群。
圖7 實體瘤MRD檢測篩選阿替珠單抗獲益人群
PART 04
熙寧生物|精翰生物WES檢測服務(wù)
熙寧生物|精翰生物WES檢測服務(wù)全面覆蓋變異類型，包含點突變、小片段插入缺失、拷貝數(shù)變異、融合變異和結(jié)構(gòu)變異，可以支持HRD檢測、TMB分析和MSI檢測，可以指導(dǎo)靶向治療和免疫治療，預(yù)測化療療效，評估遺傳風(fēng)險，并進行生物標志物的探索，具有如下的核心優(yōu)勢：
· 基于GRCh38和GRC官網(wǎng)最新的補丁序列，真實覆蓋99.9%以上主流數(shù)據(jù)庫CDS區(qū)；
· 增加641個腫瘤核心相關(guān)基因的探針密度，避免關(guān)鍵基因的漏檢，檢測全面的同時節(jié)省測序成本；
· 基于中國人群遺傳背景以及療效數(shù)據(jù)開發(fā)的適合中國人群的HRD檢測位點，HRD檢測更準確；
· 覆蓋15個經(jīng)典MSI位點，可支持MSI及TMB等生物標志物探索；
· 覆蓋38個熱點融合相關(guān)內(nèi)含子區(qū)域，提高融合檢出陽性率；
· 滿足低起始量、低質(zhì)量樣本建庫需求。
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參考文獻
[1] Bellmunt J, Hussain M, Gschwend JE, et al. Adjuvant atezolizumab versus observation in muscle-invasive urothelial carcinoma (IMvigor010): a multicentre, open-label, randomised, phase 3 trial. Lancet Oncol. 2021;22(4):525-537. doi:10.1016/S1470-2045(21)00004-8
[2] Powles T, Assaf ZJ, Davarpanah N, et al. ctDNA guiding adjuvant immunotherapy in urothelial carcinoma. Nature. 2021;595(7867):432-437. doi:10.1038/s41586-021-03642-9
