疫苗研發(fā)是一個復(fù)雜而漫長的過程。免疫原性是疫苗研發(fā)各個階段(從臨床前疫苗候選物的免疫原性評價到臨床研究及上市后研究)及疫苗有效性評價時需要關(guān)注的重要指標(biāo)之一。疫苗大多是通過刺激機體產(chǎn)生特異性抗體而發(fā)揮其預(yù)防作用。
以mRNA疫苗為例,mRNA疫苗的核心作用機理是將mRNA序列導(dǎo)入到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),利用宿主細(xì)胞將mRNA翻譯為蛋白抗原,最終介導(dǎo)機體產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答,并形成免疫記憶。在抗原特異性免疫應(yīng)答過程中,B淋巴細(xì)胞特異性活化,產(chǎn)生抗原特異性抗體,介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。同時,輔助T細(xì)胞(CD4+)以及殺傷性T細(xì)胞(CD8+)活化,分泌細(xì)胞因子,活化B淋巴細(xì)胞,發(fā)揮細(xì)胞毒作用,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答 [1]。相較于傳統(tǒng)的滅活疫苗或者亞單位疫苗,mRNA編碼的抗原可以在機體內(nèi)較為持久地產(chǎn)生,介導(dǎo)較為持續(xù)且強烈的免疫應(yīng)答,具有明顯的免疫保護力優(yōu)勢。
圖1 疫苗誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng) [2]
PART 01
細(xì)胞免疫
細(xì)胞免疫指T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,即T細(xì)胞受到抗原刺激后,分化、增殖、轉(zhuǎn)化為致敏T細(xì)胞(也稱效應(yīng)T細(xì)胞),當(dāng)相同抗原再次進入機體的細(xì)胞中時,致敏T細(xì)胞對抗原的直接殺傷作用及致敏T細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子的協(xié)同殺傷作用。T細(xì)胞的免疫特性不僅決定了疫苗保護性的細(xì)胞免疫,也決定著體液免疫的誘導(dǎo),與持久免疫和誘導(dǎo)廣泛中和抗體相關(guān)的疫苗的功效。
傳統(tǒng)的T 細(xì)胞在表型和功能上具有多樣性,并且在抗病毒持久保護中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。根據(jù)T細(xì)胞表面受體和功能不同,分為輔助性T細(xì)胞(CD4+ T淋巴細(xì)胞)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+ T淋巴細(xì)胞)和抑制性T細(xì)胞。CD8+ T細(xì)胞直接攻擊和殺死病毒感染細(xì)胞,而CD4+ T細(xì)胞則是啟動CD8+ T細(xì)胞和B 細(xì)胞的關(guān)鍵細(xì)胞。呼吸道中的CD8+毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL)通過直接殺死受感染的細(xì)胞來抑制病毒復(fù)制,并分泌包括干擾素γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF-α) 在內(nèi)的抗病毒細(xì)胞因子。CD4+ T輔助細(xì)胞則具有多種調(diào)節(jié)抗病毒免疫的關(guān)鍵功能,肺中的記憶 CD4+ T 細(xì)胞通過Th1細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-2、干擾素γ、腫瘤壞死因子等)依賴性等機制控制早期病毒的復(fù)制。
此外,T細(xì)胞耗竭和功能障礙是誘導(dǎo)疫苗細(xì)胞免疫的重要影響因素。例如,在新冠患者中大多表現(xiàn)出淋巴細(xì)胞減少的癥狀,其中優(yōu)先影響T細(xì)胞群,淋巴細(xì)胞減少和T細(xì)胞衰竭可能是新冠患者臨床惡化的主要原因之一,而T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)也可能是導(dǎo)致重癥患者繼發(fā)性并發(fā)癥的主要因素。
更高的安全性、更長效的持久免疫、誘導(dǎo)更廣泛的中和抗體以及誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是疫苗開發(fā)的當(dāng)前趨勢。越來越多的研究表明特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答在疫苗的預(yù)防以及保護階段起著非常重要的作用。
圖2 疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答 [3]
PART 02
細(xì)胞免疫原性在疫苗研究中的應(yīng)用
2.1 細(xì)胞免疫原性在新冠研究中的應(yīng)用
針對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的中和抗體可以免受病毒的侵害或發(fā)揮強有力的保護作用,然而,大約30%的患者體內(nèi)幾乎不存在新冠病毒中和抗體,這表明有其他免疫機制參與了病毒康復(fù)清除。除此之外,與特異性抗體短效性相比,新冠特異性CD8+ T細(xì)胞相對持久且保持穩(wěn)定,在感染12個月后仍被檢測到,這也進一步表明T細(xì)胞在對抗新冠病毒的免疫記憶中的重要性,并且可能介導(dǎo)長期的抗病毒保護 [4-6]。
圖3 T 細(xì)胞對新冠病毒的免疫反應(yīng) [7]
不同人群中新冠病毒特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)也有所不同 [8]。有研究通過分析2019冠狀病毒病COVID-19患者、COVID-19康復(fù)患者、未暴露群體和疫苗接種人群的新冠病毒特異性T細(xì)胞應(yīng)答及新型冠狀病毒T細(xì)胞免疫的人群特征,大量的研究發(fā)現(xiàn)體液免疫和細(xì)胞免疫均參與了人體對SARS-CoV-2的保護和清除,SARS-CoV-2可以引起COVID-19 患者T細(xì)胞應(yīng)答, T細(xì)胞活化程度與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān),大多數(shù)急性期重癥患者中可檢測到SARS-CoV-2特異性抗體反應(yīng),部分患者可能存在抗體延遲反應(yīng),而所有重癥患者的細(xì)胞反應(yīng)在急性期均受損,且COVID-19康復(fù)患者體內(nèi)存在記憶T細(xì)胞,能對外來的新冠抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。COVID-19特異性抗體反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)在康復(fù)患者可維持較長時間,重癥患者的免疫應(yīng)答顯著強于輕癥患者 [9-11] 。
通過干擾素-γ的酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)或激活誘導(dǎo)標(biāo)記(AIM)等病毒特異性T 細(xì)胞應(yīng)答的激活驗證,病毒特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)強烈偏向于Th1細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α 和IL-2),及很少的Th2細(xì)胞因子(IL-4 和IL-6)。此外,部分未暴露健康人群的T細(xì)胞也能被COVID-19抗原激活,預(yù)示了交叉反應(yīng)和預(yù)存免疫的存在,疫苗接種人群體內(nèi)存在特異性記憶淋巴細(xì)胞從而抵御新冠病毒入侵 [12]。
圖4 CD4+T和CD8+T細(xì)胞在新冠感染后保持12個月的記憶性細(xì)胞應(yīng)答 [13]
2.2 細(xì)胞免疫原性在水痘-帶狀皰疹病毒疫苗研究
帶狀皰疹是一種常見的病毒感染性疾病,嚴(yán)重影響患者特別是老年患者的生活質(zhì)量。帶狀皰疹是由初次感染后潛伏在脊髓后根神經(jīng)節(jié)或顱內(nèi)神經(jīng)節(jié)內(nèi)的水痘?帶狀皰疹病毒(varicella?zoster virus,VZV)再激活引發(fā)的一種常見的感染性疾病,主要影響老年人群,發(fā)生帶狀皰疹后神經(jīng)痛是最重要的并發(fā)癥,其疾病負(fù)擔(dān)重,生活質(zhì)量影響大 [14]。
VZV初次感染后數(shù)天或數(shù)周內(nèi)可在血清中檢測到特異性IgM、IgG和IgA以及VZV特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(VZV cell?mediated immune,VZV?CMI)。其中特異性抗體水平可維持終生,能有效預(yù)防水痘再次發(fā)生,而VZV?CMI對控制VZV細(xì)胞內(nèi)感染、維持VZV潛伏狀態(tài)并預(yù)防帶狀皰疹發(fā)生至關(guān)重要。老齡化、疾病或使用免疫抑制劑等因素,可導(dǎo)致VZV?CMI水平下降,并成為帶狀皰疹發(fā)生的重要條件。研究證實,發(fā)生帶狀皰疹后預(yù)防復(fù)發(fā)主要依靠再次升高的VZV?CMI水平而不依賴特異性抗體。免疫功能低下的帶狀皰疹患者由于不能有效形成并維持較高水平的VZV?CMI,是疾病復(fù)發(fā)的重要基礎(chǔ)。
接種疫苗提升人體VZV?CMI水平是預(yù)防和降低發(fā)生帶狀皰疹的主要機制,這在健康人及疾病狀態(tài)下均得到證實。帶狀皰疹疫苗可提高VZV?CMI和體液免疫兩個方面的應(yīng)答水平,前者很可能是阻止VZV再激活以達到預(yù)防帶狀皰疹的主要機制,但體液免疫可通過抗體依賴細(xì)胞毒效應(yīng)等途徑發(fā)揮一定的作用 [15]。
Shingrix是葛蘭素史克公司研發(fā)生產(chǎn)的含佐劑的重組帶狀皰疹疫苗(recombinant zoster vaccine, RZV),包含50 μg VZV糖蛋白E(glycoprotein E,gE)和AS01B佐劑系統(tǒng)。其中g(shù)E是VZV衣殼的主要成分,是激發(fā)VZV特異性抗體和T細(xì)胞應(yīng)答的主要靶抗原。AS01B可導(dǎo)致注射部位肌肉和引流淋巴結(jié)中先天性免疫應(yīng)答的快速而短暫激活,進而使活化的抗原呈遞細(xì)胞數(shù)量增加,促進產(chǎn)生高水平的gE 特異性CD4+T細(xì)胞和抗體。臨床試驗結(jié)果顯示Shingrix疫苗的整體有效性為97.2%,在50~59歲人群中保護率為96.6%,對60~69歲的人群保護率為97.4%,而在≥70歲人群中保護率也能達到97.9% [16] 。
VZV特異性抗體及VZV?CMI是評價帶狀皰疹疫苗免疫原性的兩個重要指標(biāo)。在細(xì)胞免疫應(yīng)答評價中,胞內(nèi)因子染色分析2種及以上細(xì)胞因子(IFN-γ,IL-2,TNF-α,CD40L)的VZV特異性CD4+ T細(xì)胞水平,顯示gE/AS01B誘導(dǎo)出較高的VZV特異性CD4+ T細(xì)胞水平,但未能誘導(dǎo)出CD8+ T細(xì)胞。長達10年隨訪研究發(fā)現(xiàn),體液免疫水平是接種前的6.0倍,細(xì)胞免疫水平是接種前的3.5倍,此外,相關(guān)的數(shù)學(xué)模型也預(yù)測疫苗相關(guān)免疫應(yīng)答在首次疫苗接種后可維持至少20年 [17-18] 。
圖5 胞內(nèi)細(xì)胞因子因子染色分析Shingrix疫苗免疫后2種及以上細(xì)胞因子的VZV特異性CD4+ T細(xì)胞水平 [17-18]
圖6 Shingrix疫苗免后10年隨訪研究的體液免疫和細(xì)胞免疫水平變化 [17-18]
2.3 細(xì)胞免疫原性在腫瘤治療性疫苗研究中的應(yīng)用
腫瘤治療性疫苗是指通過誘導(dǎo)或增強機體針對腫瘤抗原的特異性主動免疫反應(yīng),從而達到控制和殺傷腫瘤細(xì)胞、清除微小殘留病灶以及建立持久的抗腫瘤記憶等治療目的的一類產(chǎn)品,包括但不限于細(xì)胞載體疫苗、病毒載體疫苗、蛋白/多肽疫苗、核酸(DNA或RNA)疫苗等類型。
大多數(shù)腫瘤治療性疫苗的作用機制是通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)將抗原加工并呈遞給T細(xì)胞,從而誘導(dǎo)產(chǎn)生或放大已存在的抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng),尤其是細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng),以攻擊腫瘤細(xì)胞。此外,T細(xì)胞還可以輔助B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體殺傷腫瘤細(xì)胞。
圖7 mRNA-4157可以激活腫瘤新生抗原的特異性T細(xì)胞,誘導(dǎo)新生抗原特異性CD8+ T細(xì)胞的增殖 [19]
Moderna mRNA-4157為一種個性化腫瘤疫苗,靶向患者的特異性突變,編碼最多至34種新生抗原,這些新抗原是根據(jù)每位患者腫瘤獨特的DNA序列突變特征設(shè)計而成。當(dāng)將此癌癥疫苗注射入體內(nèi)時,這些RNA所攜帶的新抗原序列會被翻譯成蛋白質(zhì),并通過體內(nèi)的抗原呈遞,刺激產(chǎn)生T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)。臨床研究結(jié)果表明,mRNA-4157可以激活腫瘤新生抗原的特異性T細(xì)胞,誘導(dǎo)新生抗原特異性CD8+ T細(xì)胞的增殖,進而殺傷腫瘤細(xì)胞。同時,mRNA-4157與Keytruda聯(lián)用可加強T細(xì)胞介導(dǎo)的對腫瘤細(xì)胞的破壞,可以顯著降低III、IV期黑色素瘤患者在腫瘤完全切除后的復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險。目前,Moderna公司和默沙東宣布,首個mRNA個性化癌癥疫苗mRNA-4157和抗PD-1單抗(Keytruda)組合療法推進到了3期臨床試驗,這也是全球首個進入3期臨床試驗的mRNA癌癥疫苗。
2.4 細(xì)胞免疫原性在新佐劑研究中的應(yīng)用
佐劑(Adjuvant)作為一類添加在疫苗中的免疫調(diào)節(jié)劑,相比只使用抗原,當(dāng)其先于抗原或與抗原混合注入機體后,能極大增強疫苗的免疫應(yīng)答水平或者改變免疫反應(yīng)的類型。佐劑最主要的作用是促進機體產(chǎn)生針對抗原特異性的體液與細(xì)胞免疫,涉及到抗原遞呈細(xì)胞對抗原的攝取、抗原的處理以及抗原的遞呈等方面??乖f呈細(xì)胞又稱輔佐細(xì)胞,是機體內(nèi)具有攝取、處理和傳遞抗原信息,誘發(fā)T細(xì)胞和 B細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答作用的細(xì)胞,主要包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞等。
佐劑增強免疫應(yīng)答的機制尚未完全闡明,不同佐劑的作用也各有不同。最主要的作用是促進機體產(chǎn)生針對抗原特異性的體液與細(xì)胞免疫,涉及到抗原提呈細(xì)胞對抗原的攝取、抗原的處理以及抗原的提呈等方面,且多佐劑效應(yīng)也不能通過單一機理進行解釋。
PART 03
結(jié) 語
熙寧生物|精翰生物具備完善的細(xì)胞免疫研究(ELISPOT和ICS)解決方案和數(shù)據(jù)匯報體系,自主開發(fā)的全血穩(wěn)定劑可解決疫苗細(xì)胞免疫研究臨床運營痛點,在大樣本項目的管理方面擁有豐富的經(jīng)驗,可提供完善的中心實驗室服務(wù)。
與此同時,熙寧生物|精翰生物具有豐富的疫苗研究和抗傳染病領(lǐng)域研究經(jīng)驗,具有完備的生物分析服務(wù)平臺,支持臨床和臨床前研究,可實現(xiàn)基于配體結(jié)合實驗的結(jié)合抗體檢測,基于活病毒或報告基因的中和抗體檢測,基于ELISPOT和ICS的細(xì)胞免疫檢測,以及基于PCR的病毒分型和載量的檢測,覆蓋呼吸道合胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒、破傷風(fēng)毒素、乙肝病毒和治療性腫瘤疫苗等研究領(lǐng)域。未來,熙寧生物|精翰生物仍將根據(jù)臨床試驗需求繼續(xù)開發(fā)更加準(zhǔn)確、靈敏、快捷以及解決臨床運營痛點的檢測方法和解決方案,助力疫苗和抗傳染病領(lǐng)域臨床研究。
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[19] https://www.modernatx.com.
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