隨著科技的不斷進步,免疫組庫測序方法正為我們提供越來越深入的洞察力,揭示著免疫系統(tǒng)的奧秘。在本文中,我們將深入探討免疫組庫測序的方法和技術(shù),解析其背后的科學(xué)原理,以及如何利用這一技術(shù)來揭示免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性。通過了解免疫組庫測序的工作流程和應(yīng)用,我們可以更好地理解人體免疫系統(tǒng)如何應(yīng)對病原體侵襲、疾病發(fā)展以及免疫相關(guān)治療的潛在機制。本文將帶領(lǐng)您深入了解免疫組庫測序方法的精髓,讓我們一起走進這個神奇的科學(xué)領(lǐng)域,探尋免疫系統(tǒng)的奧秘之旅!
PART 01
免疫組庫檢測方法
分析免疫系統(tǒng)的傳統(tǒng)方法,如流式細(xì)胞術(shù)和免疫顯微鏡光譜分型,存在諸多的局限性,費時費力且費用昂貴[1]。
在下一代測序(NGS)技術(shù)之前,最常見的分析免疫受體的方法是Sanger測序,但Sanger測序數(shù)據(jù)通量較低,成本較高,運行時間較長。與Sanger測序相比,NGS可以以更低的成本、更高的通量和更短的運行時間對免疫系統(tǒng)進行更廣泛的檢測,因此,NGS技術(shù)成為免疫組庫檢測最常用的技術(shù)。NGS免疫組庫測序涉及幾個過程,包括細(xì)胞處理、核酸提取、文庫制備、測序和生物信息學(xué)分析(圖1)。
圖1 免疫組庫測序和分析過程[1]
PART 02
擴增模板選擇
文庫制備是生成免疫組庫測序純文庫的基礎(chǔ),文庫制備可以使用gDNA作為模板,使用V和J片段引物,或者使用cDNA作為模板,使用V前導(dǎo)引物、內(nèi)部V引物、J引物或恒定區(qū)引物(圖3)。除了體細(xì)胞突變對引物結(jié)合的潛在影響相關(guān)的考慮因素外,兩種原料模板各有優(yōu)劣,主要取決于檢測的目標(biāo)。gDNA與細(xì)胞數(shù)量成比例相關(guān),因此通常用于計算抗原特異性或靶T/B細(xì)胞的比例;而信使核糖核酸與細(xì)胞功能/活化密切相關(guān)。
gDNA模板的優(yōu)勢是,它允許分析產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物的有效重排基因序列,以及在V(D)J重排過程中非編碼重排基因序列,非編碼重排基因序列雖然不產(chǎn)生功能蛋白,但提供了Ig基因座重排特征的信息,如基因片段重排頻率、核酸外切酶進行的片段消化以及非模板堿基插入水平。這可用于評估與受體基因重排或B細(xì)胞選擇相關(guān)的免疫表型,例如免疫缺陷疾病。每個細(xì)胞只有一個有效重排的TCR/BCR基因座,因此gDNA可評估細(xì)胞群中T/B細(xì)胞克隆的大小。相反,在單個T/B細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生多個mRNA拷貝,并且TCR/BCR重排基因在不同細(xì)胞亞群中mRNA表達水平不同,例如在幼稚細(xì)胞中表達較低,在漿母細(xì)胞中的高表達,意味著如果只有單個RNA樣品可用于分析,則不能可靠地區(qū)分具有高TCR/BCR mRNA表達的細(xì)胞的存在。然而,使用RNA作為測序起始原料模板還有其他優(yōu)勢,主要是它能夠鑒定與特定V(D)J重排相關(guān)的重鏈類型,RNA模板的另一個潛在優(yōu)勢是,它保留細(xì)胞樣品中存在的T/B細(xì)胞克隆的完整性,因為每個B細(xì)胞可以貢獻其TCR/BCR重排的多個mRNA拷貝,因此,如果在純化過程中丟失一些模板,樣品中代表的T/B細(xì)胞克隆的數(shù)量不會像gDNA那樣線性減少。最后,重排的gDNA片段僅占總DNA量的一小部分,而cDNA每ng擴增的模板含有更多可擴增的cDNA模板。由于可以添加到PCR反應(yīng)中的DNA模板的量是有限的,因此與gDNA模板相比,使用cDNA模板可以用更少的PCR反應(yīng)得到更復(fù)雜的BCR/TCR重排文庫(表1)。
表1 gDNA和mRNA作為文庫擴增原料模板的優(yōu)劣[1]
PART 03
文庫構(gòu)建擴增方法選擇
文庫制備的擴增方法也是非常重要的,常用的方法有多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(mPCR)和5’RACE。mPCR使用混合引物來捕獲多個區(qū)域,引物設(shè)計主要集中在框架(FR)區(qū)域FR1、FR2和FR3上,該區(qū)域的突變相對少于CDR區(qū)更少,可能是由于框架(FR)區(qū)突變破壞抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,導(dǎo)致B細(xì)胞在體內(nèi)的持久性受到影響。這種擴增方法既可用于gDNA,也可用于mRNA。擴增原理與普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相似,只是引物數(shù)量增多。但不同引物之間存在效率差異和交叉反應(yīng)性,導(dǎo)致擴增產(chǎn)物中引入偏差,需要對引物設(shè)計和引物濃度進行優(yōu)化[1]。
5’RACE僅用于捕獲mRNA,一組基因特異性引物能夠與3’端基因片段互補結(jié)合,使用V、J或恒定區(qū)內(nèi)的引物,可以最大限度地減少引物偏倚和多重PCR引入的偏差,同時也有利于擴增引物結(jié)合位點發(fā)生突變的lg序列。然而,對一個基因座上所有V基因片段分析顯示,一些可能具有短的5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)(UTR)(短至30bp),而一些可能具有非常長的5’UTR(高達9kb)(圖2,圖3)。因此,通過這種方法制作的文庫可能偏好于較短的序列,這種方法的擴增建庫可能更復(fù)雜,需要RNA作為起始材料,缺少基因組DNA重排的分析,檢測性能受限于RNA樣本總量和質(zhì)量,以及逆轉(zhuǎn)錄酶的效率??傊?,這兩種方法各有優(yōu)缺點(表2)。
圖2 TCR文庫構(gòu)建過程[4]
注:(A)多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的過程
(B) 5‘RACE的過程
圖3 使用gDNA或cDNA生產(chǎn)IgH文庫[3]
注:上圖顯示了編碼抗體重鏈的重排gDNA。左引物設(shè)計在框架1、2或3(FR1、FR2、FR3)區(qū)域(用帶圓圈的數(shù)字1、2和3標(biāo)記),互補右引物設(shè)計在與J基因片段互補區(qū)域(標(biāo)記4),PCR可擴增VDJ基因重排。左側(cè)框架引物組顯示了多個引物,表明擴增不同家族的V片段所需的不同引物。前導(dǎo)肽外顯子通過短內(nèi)含子與V片段分開。下圖顯示了由編碼重鏈的成熟mRNA產(chǎn)生的cDNA。與恒定區(qū)雜交的引物(標(biāo)記為6)可以用作5’RACE方案的初始特異性引物,或者可以與前導(dǎo)序列中的引物(標(biāo)為5)或框架引物一起進行PCR,擴增VDJ基因重排。與VDJ基因重排相關(guān)的恒定區(qū)不同類型可以在該文庫中進行鑒別。
表2 mPCR和5’RACE兩種擴增方法的優(yōu)劣[1]
免疫組庫測序是一個復(fù)雜的過程,需要專業(yè)人員操作以便最大限度地減少測序錯誤,在文庫制備和測序中都可能引入錯誤,文庫制備可能會在核酸提取和PCR擴增過程中引入錯誤,而測序錯誤源于不同的測序平臺以及測序上機文庫的濃度和純度。為了減少測序錯誤,可以使用一些校正方法,如聚類算法和獨特的DNA條形碼技術(shù)。聚類算法的是通過將相似的序列分組在一起來降低測序誤差,獨特的DNA條形碼技術(shù)是添加獨特的分子標(biāo)簽(UMI),調(diào)整PCR過程中的誤差或擴增偏差[1]。
PART 04
其他免疫組庫檢測技術(shù)
最近的研究中,RNA-seq也用于研究免疫系統(tǒng),雖然該方法提供了更全面的基因表達信息,但這種方法并不能提供完整的轉(zhuǎn)錄組序列,但這對于在更多細(xì)胞中鑒定低豐度CDR3序列是必要的,因此,RNA-seq敏感性不足以進行嚴(yán)格的免疫組庫分析[1]。另外還有新發(fā)展的單細(xì)胞測序技術(shù),基于流式細(xì)胞術(shù)、微流體設(shè)備和微孔板來分離單細(xì)胞,然后通過具有獨特條形碼的液滴或具有磁珠的乳液制備文庫,進行高通量測序,單細(xì)胞分離技術(shù)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合,有助于獲得單細(xì)胞高通量數(shù)據(jù),可以剖析B細(xì)胞重鏈:輕鏈和T細(xì)胞α鏈:β鏈或δ鏈:γ鏈的配對信息,分析特定疾病抗體庫,但由于單細(xì)胞測序檢測成本高、檢測流程繁瑣、數(shù)據(jù)解讀分析復(fù)雜等問題,整體適用范圍有限。
本文我們深入介紹了免疫組庫測序的方法和技術(shù),解析了其在科學(xué)研究領(lǐng)域中的重要性和應(yīng)用。從測序樣本的準(zhǔn)備到數(shù)據(jù)分析的過程,一步步揭示了免疫組庫測序技術(shù)的精髓和復(fù)雜性,展現(xiàn)了這一技術(shù)在揭示免疫系統(tǒng)機制中的不可或缺的作用。
下一篇文章將帶您進入免疫組庫測序在藥物研發(fā)中的應(yīng)用領(lǐng)域,探討免疫組庫測序如何在藥物研發(fā)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,幫助研發(fā)人員更好地理解免疫系統(tǒng)在疾病治療中的作用機制,揭示潛在的藥物靶點和治療策略。
熙寧|精翰NGS實驗室應(yīng)用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地擴增TCR/Ig受體鏈編碼基因(TRB、TRD、TRG,以及IgH、IgL、IgK),檢測T/B細(xì)胞受體基因的克隆性重排,在時序樣本檢測中,通過檢測患者體內(nèi)TCR譜系的變化來評估治療效果以及跟蹤疾病進展或復(fù)發(fā)。本檢測方法已經(jīng)經(jīng)過了完善的性能驗證,可以供申辦方直接使用。歡迎您后臺留言咨詢。
參考文獻:
[1] Liu H, Pan W, Tang C, Tang Y, Wu H, Yoshimura A, Deng Y, He N, Li S. The methods and advances of adaptive immune receptors repertoire sequencing. Theranostics. 2021 Aug 19;11(18):8945-8963. doi: 10.7150/thno.61390. PMID: 34522220; PMCID: PMC8419057.
[2] Aran A, Garrigós L, Curigliano G, Cortés J, Martí M. Evaluation of the TCR Repertoire as a Predictive and Prognostic Biomarker in Cancer: Diversity or Clonality? Cancers (Basel). 2022 Mar 31;14(7):1771. doi: 10.3390/cancers14071771. PMID: 35406543; PMCID: PMC8996954.
[3] Boyd SD, Joshi SA. High-Throughput DNA Sequencing Analysis of Antibody Repertoires. Microbiol Spectr. 2014 Oct;2(5). doi: 10.1128/microbiolspec.AID-0017-2014. PMID: 26104353.
[4] Li N, Yuan J, Tian W, Meng L, Liu Y. T-cell receptor repertoire analysis for the diagnosis and treatment of solid tumor: A methodology and clinical applications. Cancer Commun (Lond). 2020 Oct;40(10):473-483. doi: 10.1002/cac2.12074. Epub 2020 Jul 17. PMID: 32677768; PMCID: PMC7571402.
[5] Joshi K, Milighetti M, Chain BM. Application of T cell receptor (TCR) repertoire analysis for the advancement of cancer immunotherapy. Curr Opin Immunol. 2022 Feb;74:1-8. doi: 10.1016/j.coi.2021.07.006. Epub 2021 Aug 25. PMID: 34454284.
[6] 12 Zhang S, Yang T, Liu X, Yang J, Zheng X. Antibody repertoire sequencing analysis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2022 May 25;54(6):864-873. doi: 10.3724/abbs.2022062. PMID: 35713313; PMCID: PMC9828323.
[7] Nixon AB, Schalper KA, Jacobs I, Potluri S, Wang IM, Fleener C. Peripheral immune-based biomarkers in cancer immunotherapy: can we realize their predictive potential? J Immunother Cancer. 2019 Nov 27;7(1):325. doi: 10.1186/s40425-019-0799-2. PMID: 31775882; PMCID: PMC6880594.
[8] Schrama D, Ritter C, Becker JC. T cell receptor repertoire usage in cancer as a surrogate marker for immune responses. Semin Immunopathol. 2017 Apr;39(3):255-268. doi: 10.1007/s00281-016-0614-9. Epub 2017 Jan 10. PMID: 28074285.
[9] Porciello N, Franzese O, D'Ambrosio L, Palermo B, Nisticò P. T-cell repertoire diversity: friend or foe for protective antitumor response? J Exp Clin Cancer Res. 2022 Dec 22;41(1):356. doi: 10.1186/s13046-022-02566-0. PMID: 36550555; PMCID: PMC9773533.