免疫系統(tǒng)對(duì)外來(lái)和自身抗原的區(qū)分不是絕對(duì)的,在某些情況下,機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的異常,會(huì)導(dǎo)致機(jī)體攻擊自身組織,這類疾病被稱為“自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AIDs)”。AIDs在人群中的發(fā)病率極高,約7~9% [1]。目前已確定的81種AIDs[2],根據(jù)組織受損的程度被分為:(1)器官特異性疾病,如I型糖尿?。═1DM)、多發(fā)性硬化癥(MS)、炎癥性腸病(IBD)和重癥肌無(wú)力(MG)等;(2)全身性疾病,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和Sj?gren綜合征(SS)等。
免疫系統(tǒng)攻擊自身組織,主要由T和B淋巴細(xì)胞參與,這一過(guò)程被認(rèn)為會(huì)促進(jìn)疾病的進(jìn)展。先前的研究表明,多種AIDs患者體內(nèi)都存在TCR異常表達(dá)。此外,在一些AIDs中發(fā)現(xiàn)了TCR庫(kù)的變化,這可能是因?yàn)橥庵苊庖吣褪茉獾搅似茐?。正常情況下,TCR是隨機(jī)重排的,CDR3長(zhǎng)度的分布大致為高斯分布[3]。然而,在一些AIDs中,TCR和疾病特異性CDR3克隆型的分布存在偏倚,這可能與自身抗原暴露和表位擴(kuò)增有關(guān)。因此,TCR庫(kù)測(cè)序提供了研究免疫疾病的新策略,尤其是疾病特異性的主克隆可以作為生物標(biāo)志物或免疫治療的潛在靶標(biāo),并幫助醫(yī)生監(jiān)測(cè)患者對(duì)治療干預(yù)的反應(yīng)。目前TCR庫(kù)的研究已在多種AIDs中進(jìn)行,本文將以系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、I型糖尿?。═1DM)這三類AIDs為例,簡(jiǎn)單介紹TCR庫(kù)在疾病中的作用。
PART 01
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種累及多系統(tǒng)的慢性炎癥性疾病,主要發(fā)生于年輕女性。常見表現(xiàn)可包括多關(guān)節(jié)痛和關(guān)節(jié)炎、雷諾綜合征、面頰及其他部位皮疹、胸膜炎或心包炎、腎臟或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累以及自身免疫性細(xì)胞減少。臨床上對(duì)SLE患者的TCR庫(kù)變化進(jìn)行了廣泛的研究(表1)[3]。
表1 關(guān)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡TCR庫(kù)的研究[3]
Thapa等在一項(xiàng)研究中利用NGS來(lái)評(píng)估11例SLE患者外周血中TCR庫(kù)多樣性的變化是否與疾病狀態(tài)相關(guān),或是否能預(yù)測(cè)其變化[4]。每個(gè)受試者有三個(gè)樣本,分別在疾病的臨床靜止期和爆發(fā)期收集。同時(shí)選取12名年齡匹配的健康志愿者(HC)作為對(duì)照。結(jié)果如圖1所示,與健康人相比,SLE患者(處于靜止?fàn)顟B(tài))的TCR庫(kù)多樣性減少了2.2倍(P<0.0002),tcr庫(kù)分布更不均勻(gini系數(shù),hc vs="" p="0.015),TCR庫(kù)中擴(kuò)增克隆的百分比有增加趨勢(shì)(克隆大小">1.0%,HC vs SLE, P = 0.078)。但是,在大多數(shù)SLE患者中,未觀察到總體的TCR庫(kù)多樣性與臨床疾病活動(dòng)之間有顯著相關(guān)性(圖2)。因此,在不知道SLE特異性克隆的情況下,監(jiān)測(cè)SLE患者外周血中的TCR庫(kù)可能無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)疾病活動(dòng)狀態(tài)的變化。
圖1 健康對(duì)照(HC)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者TCR庫(kù)分析[4]
注:A,通過(guò)測(cè)量每標(biāo)準(zhǔn)化血體積的克隆型數(shù)量得到的TCR庫(kù)多樣性,HC vs SLE(Mann-Whitney檢驗(yàn));B,克隆型分布的均勻性,使用Gini系數(shù),HC vs SLE(Mann-Whitney檢驗(yàn))
圖2 SLE患者TCR庫(kù)的縱向分析[4]
注:前50個(gè)無(wú)性系克隆型的頻率及相對(duì)排名。SLE患者的三個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)分別為靜止(Q)、爆發(fā)前(PF)和爆發(fā)(F)。從第一個(gè)樣本開始計(jì)算的時(shí)間(月)。水平紅線以上的克?。?gt;1%)表示高度擴(kuò)增克?。℉EC)
然而,另一些研究卻得出截然不同的結(jié)果。例如,Luo等人[5]為了尋找特異性TCR α和β鏈的保守基序,并分析CDR3譜型與SLE疾病活動(dòng)狀態(tài)之間的關(guān)系,分析20例SLE患者的TCR α和β鏈CDR3的譜型,結(jié)果表明CDR3譜型隨SLE疾病活動(dòng)狀態(tài)的變化而呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)(圖3)。
圖3 局部分析SLE患者LYJ和LSB在治療前后TCR AV和BV家族的使用變化,以及患者LYS在4個(gè)疾病階段的所有BV家族特征
PART 02
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種主要累及關(guān)節(jié)的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病,由細(xì)胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶介導(dǎo)。對(duì)稱性外周關(guān)節(jié)炎(如腕關(guān)節(jié)和掌指關(guān)節(jié))是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要特征,受累關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)進(jìn)行性破壞,并常伴有全身癥狀。科學(xué)家們?cè)谔剿鱎A患者的TCR庫(kù)多樣性方面做出了巨大的努力(表2)。
表2 關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)TCR庫(kù)的研究[3]
Jiang等人在一項(xiàng)研究[6]中將來(lái)自未經(jīng)治療的RA患者和健康志愿者的外周CD4+ T細(xì)胞分成7個(gè)亞群(na?ve、效應(yīng)、中樞記憶、效應(yīng)記憶(EMT)、Th1、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞),然后通過(guò)NGS分析TCR β鏈的譜型,結(jié)果顯示(圖4和圖5),相比于健康志愿者,在RA患者的EMT和Th17細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了更少的TCR庫(kù)多樣性和T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增,它們具有高度相似的TCR譜型。另外,此研究還發(fā)現(xiàn)TCR庫(kù)多樣性和Th17細(xì)胞的豐度與RA疾病活動(dòng)顯著相關(guān)。
圖4 RA患者的Th17和EMT細(xì)胞的多樣性低于健康對(duì)照(HC)[6],計(jì)算D20指數(shù)(a)和Shannon指數(shù)(b)
圖5 TCRB CDR3s在RA患者的Th17和EMT細(xì)胞中高度共享[6]
注:(a)計(jì)算Th17和其他亞群之間的Jaccard指數(shù),與健康對(duì)照(hc)相比,RA患者Th17和EMT細(xì)胞的CDR3s表現(xiàn)出更多的相似性;(b)在RA中,EMT(上)和Th17(下)克隆型的重疊頻率高于私有克隆型;(c)RA和HC重疊克隆型長(zhǎng)度分布,RA重疊克隆型明顯長(zhǎng)于HC重疊克隆型
此外,多項(xiàng)研究表明,RA患者的循環(huán)T細(xì)胞表現(xiàn)為TCR庫(kù)多樣性降低,其特異性擴(kuò)增的T細(xì)胞克隆型與RA的治療耐藥性和疾病活動(dòng)狀態(tài)相關(guān)[3]。
PART 03
I型糖尿?。═1DM)
I型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus,T1DM)主要是由于遺傳易感人群在環(huán)境因素作用下觸發(fā)自身免疫反應(yīng)破壞胰島β細(xì)胞,使胰島素分泌不足。 與SLE和RA類似,T1DM患者也發(fā)現(xiàn)TCR庫(kù)多樣性降低(表3)。
表3 關(guān)于I型糖尿病TCR庫(kù)的研究[3]
例如,Tong等人[7]為了系統(tǒng)地研究潛在的自身反應(yīng)性TCRs,使用NGS對(duì)9名T1DM患者、4名T2DM患者和6名健康對(duì)照組的T細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示,與T2D患者和健康對(duì)照組相比,T1D患者T細(xì)胞庫(kù)的多樣性顯著降低(圖6)。此外,T1D患者的T細(xì)胞克隆高度擴(kuò)增明顯高于T2D患者和健康對(duì)照組。結(jié)果表明TCR庫(kù)多樣性分析可能成為研究糖尿病的有價(jià)值工具。
圖6 CD4+ T細(xì)胞TCRB庫(kù)的多樣性及克隆指數(shù)[7]
注:(a)產(chǎn)生的唯一序列(唯一克隆型)的數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量相關(guān)(Spearman’s R = 0.85,p < 0.0001)。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化,計(jì)算真多樣性指數(shù)(b)和Gini系數(shù)(c)。來(lái)自患者的TN細(xì)胞克隆性低于來(lái)自健康供體的TN細(xì)胞(Mann-Whitney U檢驗(yàn))。物種被定義為一個(gè)獨(dú)特的核苷酸序列。(d-f)真多樣性指數(shù)在TN、CM和Tscm細(xì)胞亞群之間呈正相關(guān),與CM和Tscm從TN傳代一致(Pearson相關(guān)性)。TN,真幼稚細(xì)胞;CM,中央記憶細(xì)胞;Treg,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;Tscm,干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞
在另外一項(xiàng)研究[8]中,Gomez-Tourino等人通過(guò)分析來(lái)自T1DM患者和健康志愿者的循環(huán)初始、中樞記憶、調(diào)節(jié)性和干細(xì)胞樣記憶CD4+ T細(xì)胞亞群的>2×108個(gè)TCRB序列,發(fā)現(xiàn)在所有細(xì)胞亞群中,患者的TCRB的CDR3序列長(zhǎng)度更短,在非生產(chǎn)性TCRB序列中也觀察到高頻率的短CDR3序列(圖7)。此外,與抗病毒T細(xì)胞和健康志愿者相比,由自身抗原特異性CD4+ T細(xì)胞表達(dá)的TCRB CDR3克隆型更短,表明短CDR3序列增加了自我識(shí)別的能力,從而增加了自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
圖7 在T1D患者中TCRB CDR3s較短以及具有較大的相似性[8]
注:來(lái)自(a)TN、(b)CM、(c)Treg和(d)Tscm細(xì)胞的TCRB CDR3生產(chǎn)獨(dú)特序列的核苷酸長(zhǎng)度在患者中呈現(xiàn)偏倚的長(zhǎng)度分布。e, f計(jì)算了14名健康供體(e)和14名T1D患者(f)的TN和CM TCRB的重疊指數(shù)。(g)TN/TN、(h)CM/CM和(i)TN/CM 細(xì)胞亞型的重疊指數(shù)(Mann-Whitney U檢驗(yàn))。*p < 0.05,***p < 0.001。線代表平均值±SD
除上述提到的幾種AIDs外,研究人員還探索了許多其他AIDs患者的TCR庫(kù),如MS、IBD、SSc、PBC等。相關(guān)研究總結(jié)如表4 [3]。
表4 關(guān)于其他自身免疫性疾病TCR庫(kù)的研究[3]
PART 04
小結(jié)
在過(guò)去的幾十年里,人們對(duì)T淋巴細(xì)胞及其亞群在AIDs的發(fā)生和發(fā)展中的復(fù)雜而重要的作用有了更多的了解,但仍有許多未解之謎,比如TCR庫(kù)在AIDS中的細(xì)胞和分子機(jī)制。了解AIDs患者體內(nèi)的疾病特異性主克隆型有助于建立一套可靠的生物標(biāo)志物用于診斷、預(yù)測(cè)疾病狀態(tài)以及發(fā)展個(gè)性化的免疫治療。
熙寧|精翰NGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用基于多重PCR建庫(kù)的免疫組庫(kù)檢測(cè)方法特異性地?cái)U(kuò)增TCR/Ig受體鏈編碼基因(TRB、TRD、TRG,以及IgH、IgL、IgK),檢測(cè)T/B細(xì)胞受體基因的克隆性重排,通過(guò)專業(yè)的生物信息學(xué)流程分析識(shí)別受體可變區(qū),統(tǒng)計(jì)樣本的克隆多樣性及V/J片段的使用頻率,從而揭示個(gè)體的免疫表達(dá)譜。本檢測(cè)方法已經(jīng)經(jīng)過(guò)了完善的性能驗(yàn)證,可以供申辦方直接使用。
熙寧|精翰NGS實(shí)驗(yàn)室依據(jù)CAP質(zhì)量的要求,建立了完善的質(zhì)量體系。實(shí)驗(yàn)室擁有NextSeq CN500測(cè)序儀,支持本地測(cè)序,且多次滿分通過(guò)CAP的能力驗(yàn)證。按照質(zhì)量體系的要求,實(shí)驗(yàn)室建立了豐富的檢測(cè)方法,全面支撐藥物的安全性評(píng)估、治療效果評(píng)估、入組篩查和生物標(biāo)志物的探索等,在藥物研發(fā)的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用:
熙寧|精翰NGS平臺(tái)可提供的檢測(cè)服務(wù)
?
以慢病毒為載體的CAR-T細(xì)胞治療中,識(shí)別有致瘤性的或者其他潛在危險(xiǎn)的整合位點(diǎn),評(píng)估整合事件的多樣性和偏好性,輔助評(píng)估藥物潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn);
?
通過(guò)對(duì)腫瘤微小殘留病灶(MRD)的檢測(cè),評(píng)估藥物治療效果并提示預(yù)后,提前提示復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)并指導(dǎo)后續(xù)干預(yù);
?
通過(guò)基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,幫助申辦方識(shí)別與疾病關(guān)聯(lián)的基因突變、融合突變和拷貝數(shù)變異等,識(shí)別受試者藥物靶點(diǎn)變異情況,以及與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和相關(guān)信號(hào)通路的基因變化,從而指導(dǎo)患者入排,發(fā)現(xiàn)藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物,并指導(dǎo)耐藥機(jī)制研究和新的治療策略開發(fā);
?
評(píng)估候選藥物對(duì)基因表達(dá)的影響,篩選出對(duì)特定靶標(biāo)有顯著作用的化合物,同時(shí)通過(guò)分析藥物處理前后基因表達(dá)變化,優(yōu)化藥物的劑量、作用機(jī)制和潛在副作用。
歡迎您后臺(tái)留言咨詢。
參考文獻(xiàn):
[1] Theofilopoulos AN, Kono DH, Baccala R. The multiple pathways to autoimmunity. Nat Immunol. 2017 Jun 20;18(7):716-724. doi: 10.1038/ni.3731. PMID: 28632714; PMCID: PMC5791156.
[2] FANG Xin-yu, LENG Rui-xue, FAN Yin-guang, ZHANG Qin, PAN Hai-feng, YE Dong-qing. Research advances in the epidemiology of autoimmune diseases[J]. CHINESE JOURNAL OF DISEASE CONTROL & PREVENTION, 2021, 25(8): 869-873. doi: 10.16462/j.cnki.zhjbkz.2021.08.001
[3] Song R, Jia X, Zhao J, Du P, Zhang JA. T cell receptor revision and immune repertoire changes in autoimmune diseases. Int Rev Immunol. 2022;41(5):517-533. doi: 10.1080/08830185.2021.1929954. Epub 2021 Jul 9. PMID: 34243694.
[4] Thapa DR, Tonikian R, Sun C, Liu M, Dearth A, Petri M, Pepin F, Emerson RO, Ranger A. Longitudinal analysis of peripheral blood T cell receptor diversity in patients with systemic lupus erythematosus by next-generation sequencing. Arthritis Res Ther. 2015 May 23;17(1):132. doi: 10.1186/s13075-015-0655-9. PMID: 26001779; PMCID: PMC4458014.
[5] Luo W, Ma L, Wen Q, Wang N, Zhou MQ, Wang XN. Analysis of the interindividual conservation of T cell receptor alpha- and beta-chain variable regions gene in the peripheral blood of patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol. 2008 Dec;154(3):316-24. doi: 10.1111/j.1365-2249.2008.03770.x. Epub 2008 Sep 22. PMID: 18811695; PMCID: PMC2633227.
[6] Jiang X, Wang S, Zhou C, Wu J, Jiao Y, Lin L, Lu X, Yang B, Zhang W, Xiao X, Li Y, Wu X, Wang X, Chen H, Zhao L, Fei Y, Yang H, Zhang W, Zhang F, Chen H, Zhang J, Li B, Yang H, Wang J, Liu X, Zhang X. Comprehensive TCR repertoire analysis of CD4+ T-cell subsets in rheumatoid arthritis. J Autoimmun. 2020 May;109:102432. doi: 10.1016/j.jaut.2020.102432. Epub 2020 Feb 27. PMID: 32115259.
[7] Tong Y, Li Z, Zhang H, Xia L, Zhang M, Xu Y, Wang Z, Deem MW, Sun X, He J. T Cell Repertoire Diversity Is Decreased in Type 1 Diabetes Patients. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2016 Dec;14(6):338-348. doi: 10.1016/j.gpb.2016.10.003. Epub 2016 Dec 24. PMID: 28024918; PMCID: PMC5200939.
[8] Gomez-Tourino I, Kamra Y, Baptista R, Lorenc A, Peakman M. T cell receptor β-chains display abnormal shortening and repertoire sharing in type 1 diabetes. Nat Commun. 2017 Nov 27;8(1):1792. doi: 10.1038/s41467-017-01925-2. PMID: 29176645; PMCID: PMC5702608.