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隨著腫瘤免疫療法的興起，免疫系統(tǒng)在腫瘤研究中的作用受到了極大的關(guān)注。免疫系統(tǒng)的一些組分或其變化，已被用于腫瘤預(yù)后或預(yù)測(cè)腫瘤免疫治療的療效。例如，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的存在被證明與一些癌癥的良好預(yù)后直接相關(guān)^[1]。然而，盡管一些患者存在高豐度的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞，但并不能保證有良好的療效。因此，需要更深入地了解腫瘤組織中免疫細(xì)胞的類型及其激活狀態(tài)、功能和特異性。作為適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵細(xì)胞效應(yīng)器，T細(xì)胞的抗原特異性由T細(xì)胞受體（TCR）決定，這意味著TCR庫(kù)（TCR repertoire）可以反應(yīng)人類免疫系統(tǒng)的狀態(tài)^[2]。因此，TCR庫(kù)被認(rèn)為是一種有前景的生物標(biāo)志物，對(duì)TCR庫(kù)的研究有助于表征腫瘤細(xì)胞與宿主適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的相互作用，指導(dǎo)如何利用現(xiàn)有或新的治療方法有效地調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，以及如何更好地預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后。

PART 01

在一項(xiàng)研究中，Charles等采用半定量多重PCR方法對(duì)44例I-IV期黑色素瘤患者的外周血和其中7例患者的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)樣本的TCR庫(kù)多樣性進(jìn)行了研究，并探討其對(duì)臨床預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)價(jià)值^[3]。作者使用兩個(gè)參數(shù)對(duì)TCR多樣性進(jìn)行量化：反映V-J重排數(shù)量的多樣性豐富度（diversity richness，DR）和反映種群克隆性的多樣性均勻度（diversity evenness，DE）。作者根據(jù)DR和DE值分析患者的無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS），發(fā)現(xiàn)患者外周血中較高的TCR庫(kù)多樣性（DR和DE參數(shù)）與較長(zhǎng)的PFS相關(guān)，而多樣性對(duì)患者OS沒(méi)有顯著影響（PFS和OS均從采樣時(shí)間開(kāi)始計(jì)算）（圖1）。作者還進(jìn)一步比較了7例患者血液和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤中TCR庫(kù)的多樣性（圖2）。盡管總體DR和DE值在血液和腫瘤之間無(wú)顯著差異，但對(duì)個(gè)體進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，患者1在血液和腫瘤中均具有最低DR值，腫瘤中具有最低DE值，在采樣后疾病進(jìn)展迅速并在采樣四個(gè)月后死亡；相反，具有良好預(yù)后和較長(zhǎng)生存期（接近4年）的患者8在血液和腫瘤中均表現(xiàn)出更高的TCR庫(kù)多樣性。綜上，這項(xiàng)研究表明黑色素瘤患者血液和腫瘤中TCR庫(kù)的多樣性具有潛在的預(yù)后價(jià)值。

圖1  DR和DE參數(shù)的數(shù)值高預(yù)示更長(zhǎng)的PFS^[3]。通過(guò)ImmunTraCkeR?評(píng)估黑色素瘤患者血液中TCR庫(kù)的多樣性，并評(píng)估其對(duì)臨床結(jié)果的影響: (a) 低DR值 (<90%, n="12)和高DR值">90%, n = 32)患者的PFS (左圖)和OS (右圖)對(duì)比; (b) DE值低于或高于中位數(shù)的患者的PFS (左圖)和OS (右圖)的對(duì)比(n = 44)。采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析

圖2  淋巴結(jié)（LN）轉(zhuǎn)移瘤的多樣性可能為臨床結(jié)果提供有用信息^[3]。通過(guò)ImmunTraCkeR^?評(píng)估黑色素瘤患者血液和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤中TCR庫(kù)的多樣性（計(jì)算多樣性豐富度和均勻度）。血液和淋巴結(jié)DR值(左圖)和DE值(右圖)的對(duì)比

除了黑色素瘤，TCR庫(kù)對(duì)于乳腺癌、宮頸癌、胃癌等惡性腫瘤同樣具有一定預(yù)后價(jià)值（表1）?？偟膩?lái)說(shuō)，更高的TCR多樣性意味著免疫系統(tǒng)具有更好協(xié)調(diào)抗腫瘤反應(yīng)的能力，所以在健康個(gè)體或疾病進(jìn)展較好的患者中，TCR庫(kù)的多樣性會(huì)更高。

表1  TCR庫(kù)多樣性在腫瘤預(yù)后中的作用^[1]

PART 02

免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）的使用已被證明可以提高多種類型腫瘤患者的生存期。到目前為止，用于預(yù)測(cè)ICIs療效的生物標(biāo)志物主要包括PD-L1表達(dá)、腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞。近年來(lái)，一些研究試圖探索TCR庫(kù)多樣性和克隆性的改變與ICIs治療期間建立的保護(hù)性腫瘤特異性反應(yīng)之間的關(guān)系，主要集中在靶向CTLA-4和PD-1的單克隆抗體這兩類ICIs對(duì)TCR庫(kù)多樣性的影響（表2）^{[1, 4]}。由于難以獲得縱向腫瘤組織樣本，這些研究大多使用循環(huán)T細(xì)胞，少數(shù)使用腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞。

表2  不同腫瘤研究中ICIs治療后的TCR庫(kù)分析^[1]

在一項(xiàng)試點(diǎn)研究中，Postow等人分析了12例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者在接受ipilimumab（anti-CTLA-4 antibody）治療前的外周血TCR庫(kù)多樣性，以確定治療前TCR庫(kù)多樣性是否與ipilimumab治療的臨床結(jié)果相關(guān)^[5]。作者通過(guò)豐富度（richness，觀察到的V-J重排）和均勻度（evenness，特定V-J重排頻率之間的相似性）這兩個(gè)參數(shù)來(lái)研究TCR庫(kù)的多樣性。臨床獲益通過(guò)ipilimumab開(kāi)始治療后腫瘤負(fù)荷減輕或疾病穩(wěn)定時(shí)間延長(zhǎng)至少9個(gè)月的證據(jù)來(lái)確定。結(jié)果顯示（圖3），有無(wú)臨床獲益的患者在TCR庫(kù)豐富度（p = 0.033）和均勻度（p = 0.028）上都存在顯著差異，低豐富度（n = 0/5, p = 0.081）和低均勻度（n = 0/7, p = 0.01）患者均沒(méi)有臨床獲益。該研究表明，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者外周血中基線TCR多樣性與ipilimumab治療的臨床結(jié)果相關(guān)。

圖3  A，有臨床獲益的患者在基線時(shí)TCR庫(kù)的豐富度更高(p = 0.033)；B，有臨床獲益的患者在基線時(shí)TCR庫(kù)的均勻度更高(p = 0.028)^[5]

此外，一些研究發(fā)現(xiàn)抗CTLA-4治療可以增加外周血中TCR庫(kù)的多樣性。例如，為了評(píng)價(jià)tremelimumab阻斷CTLA4對(duì)PBMC的免疫調(diào)節(jié)作用，Robert等人利用NGS評(píng)估了21例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者在接受tremelimumab治療前、治療30天和60天后，PBMC細(xì)胞中TCR V-beta CDR3的變化^[6]。結(jié)果顯示（圖4），接受tremelimumab治療后，19例患者TCR V-beta CDR3的unique productive sequences中位數(shù)增加了30%，另外2例中位數(shù)下降30%；治療后的豐富度（P < 0.01）和Shannon多樣性指數(shù)（P < 0.04）變化顯著。相比之下，從4名健康人的TCR V-beta CDR3多樣性在1年內(nèi)沒(méi)有顯著變化。這項(xiàng)研究說(shuō)明用tremelimumab阻斷CTLA4可以使外周T細(xì)胞庫(kù)多樣化，闡明這類抗體如何調(diào)節(jié)人類的免疫系統(tǒng)。

圖4  Unique productive sequences絕對(duì)數(shù)值的變化^[6]。A，來(lái)自21名黑色素瘤患者(GA，黑色)和4名健康人 (HD，灰色)的基線和tremelimumab治療后樣本之間的變化。B，標(biāo)準(zhǔn)化的TCR V-beta CDR3庫(kù)多樣性。分析比較PBMC樣本的基線和tremelimumab治療后CDR3庫(kù)的變化，這些數(shù)值進(jìn)行歸一化，以可比性的方式顯示治療后的增加和減少

關(guān)于抗PD-(L)-1治療，一些研究也證明了更高的基線外周TCR庫(kù)多樣性與臨床獲益之間的關(guān)聯(lián)。例如，Han等人對(duì)NSCLC患者PD-1+ CD8+ T細(xì)胞的TCRβ CDR3進(jìn)行測(cè)序，以研究其在預(yù)測(cè)NSCLC患者對(duì)抗PD-1/ PD-L1治療反應(yīng)中的作用（圖5）^[7]。兩個(gè)獨(dú)立的隊(duì)列（隊(duì)列A，n = 25；隊(duì)列B，n = 15)分別作為發(fā)現(xiàn)組和驗(yàn)證組。在隊(duì)列A中， ICB治療前PD-1+ CD8+ T細(xì)胞TCR庫(kù)多樣性高的患者對(duì)ICB治療表現(xiàn)出更優(yōu)的臨床響應(yīng)和更長(zhǎng)的PFS（6.4個(gè)月vs 2.5個(gè)月，HR，0.39；95%[CI]，0.17-0.94；P = 0.021）。類似的結(jié)果在隊(duì)列B中也得到了驗(yàn)證，說(shuō)明外周血PD-1+ CD8+ T細(xì)胞中的TCR庫(kù)多樣性可以作為預(yù)測(cè)NSCLC對(duì)ICB治療結(jié)果的生物標(biāo)志物。

圖5  TCR庫(kù)多樣性與PD-1或PD-L1抑制劑治療的反應(yīng)和PFS的相關(guān)性^[7]。A，隊(duì)列A中PD-1/PD- l1抑制劑治療后DC和PD亞組PD-1+ CD8+ TCR多樣性的比較(n = 25)。B，使用ROC曲線隊(duì)列A中區(qū)分PD患者和DC患者(n = 25)。C，隊(duì)列A的PFS通過(guò)PD-1+ CD8+ TCR庫(kù)多樣性進(jìn)行分層(n = 25)。D，隊(duì)列B的PFS通過(guò)PD-1+ CD8+ TCR多樣性進(jìn)行分層 (n = 15)。E，隊(duì)列A的OS通過(guò)PD-1+ CD8+ TCR庫(kù)多樣性進(jìn)行分層 (n = 25)。F，隊(duì)列B的OS通過(guò)PD-1+ CD8+ TCR庫(kù)多樣性進(jìn)行分層(n = 15)。G, TCR多樣性對(duì)判斷PD-1或PD- L1抑制劑的臨床反應(yīng)(DC vs PD)的敏感性和特異性(n = 40;DC, n = 23, PD, n = 17)

然而，Hogan等人在一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)TCR庫(kù)多樣性與anti-PD-1治療結(jié)果存在負(fù)相關(guān)（圖6）^[8]。在該研究中，作者采用multi-N-plex PCR技術(shù)測(cè)試了接受anti-CTLA4 (n = 42) 或anti-PD1 (n = 38)治療的黑色素瘤患者在治療前PBMC的TCR庫(kù)組合多樣性均勻度（DE50，其數(shù)值越低，代表TCR克隆越多，多樣性越少）。在多變量回歸模型中評(píng)估治療結(jié)果、臨床變量和DE50之間的相關(guān)性，并通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，低DE50數(shù)值預(yù)示著患者anti-PD-1治療有良好反應(yīng)和更長(zhǎng)的PFS，但是對(duì)于anti-CTLA-4治療預(yù)示著較差的臨床獲益。不同研究結(jié)果的差異表明，需要更深入的研究，以助于更好地了解其他因素對(duì)TCR庫(kù)變化的影響。

圖6  治療前TCR多樣性的均勻度^[8]。A，散點(diǎn)圖顯示對(duì)anti-CTLA-4治療有反應(yīng)或無(wú)反應(yīng)患者的基線DE50。N = 42。虛線，20.03%。B，散點(diǎn)圖顯示對(duì)anti-PD-1治療有反應(yīng)或無(wú)反應(yīng)患者的基線DE50水平。N = 38。虛線，20.4%。用Fisher精確檢驗(yàn)計(jì)算P值

PART 03

盡管缺乏對(duì)TCR庫(kù)如何影響癌癥發(fā)展的了解，但目前已有明確的證據(jù)表明，TCR庫(kù)在作為預(yù)測(cè)腫瘤進(jìn)展或預(yù)測(cè)ICIs治療效果的生物標(biāo)志物方面具有巨大的潛力。

熙寧|精翰NGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用基于多重PCR建庫(kù)的免疫組庫(kù)檢測(cè)方法特異性地?cái)U(kuò)增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測(cè)T/B細(xì)胞受體基因的克隆性重排，在時(shí)序樣本檢測(cè)中，通過(guò)檢測(cè)患者體內(nèi)TCR譜系的變化來(lái)評(píng)估治療效果以及跟蹤疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)。本檢測(cè)方法已經(jīng)經(jīng)過(guò)了完善的性能驗(yàn)證，可以供申辦方直接使用。

熙寧|精翰NGS實(shí)驗(yàn)室依據(jù)CAP質(zhì)量的要求，建立了完善的質(zhì)量體系。實(shí)驗(yàn)室擁有NextSeq CN500測(cè)序儀，支持本地測(cè)序，且多次滿分通過(guò)CAP的能力驗(yàn)證。按照質(zhì)量體系的要求，實(shí)驗(yàn)室建立了豐富的檢測(cè)方法，全面支撐藥物的安全性評(píng)估、治療效果評(píng)估、入組篩查和生物標(biāo)志物的探索等，在藥物研發(fā)的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用：

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參考文獻(xiàn)：

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