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腫瘤免疫療法，如免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs），已被證明在治療多種人類癌癥中發(fā)揮了重要作用，如黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和腎細(xì)胞癌等[1]。此外，患者腫瘤組織內(nèi)的免疫細(xì)胞亞群分布、相關(guān)細(xì)胞因子含量、免疫抑制狀態(tài)等已被用于多種類型癌癥的生存和預(yù)后研究[2]。同時(shí)，一些回顧性或探索性研究也顯示了腫瘤免疫微環(huán)境的狀態(tài)在預(yù)測腫瘤免疫治療效果方面的效果。
PART 01
mIHC/mIF在腫瘤免疫治療研究中的優(yōu)勢(shì)
早期，傳統(tǒng)IHC/IF顯色方法為深入了解免疫浸潤在指導(dǎo)后續(xù)臨床治療反應(yīng)中的作用提供了有價(jià)值的工具。但是，傳統(tǒng)IHC方法最大的局限性是在一張F(tuán)FPF切片上只能對(duì)1 -3個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行染色，而對(duì)于腫瘤免疫浸潤的評(píng)估，需要對(duì)多個(gè)蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行檢測，這就要求充足的組織學(xué)標(biāo)本，但大多數(shù)的活檢樣本無法滿足。相比之下，基于多重免疫組織化學(xué)/免疫熒光(mIHC/mIF)的分析可實(shí)現(xiàn)在一張F(tuán)FPE組織切片上進(jìn)行多個(gè)生物標(biāo)志物檢測，進(jìn)而提供對(duì)包含浸潤性免疫細(xì)胞、癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的復(fù)雜腫瘤微環(huán)境(TME)中各種細(xì)胞含量、分布以及空間關(guān)系的獨(dú)特視角 [3]。因此，mIHC技術(shù)可以在腫瘤免疫治療的研究中發(fā)揮重要的作用。
此外，mIHC/mIF在預(yù)測ICIs治療效果方面可能具有更高的準(zhǔn)確性。Lu等人薈萃分析了來自50多個(gè)研究的抗PD-1/PD-L1治療數(shù)據(jù)，涵蓋10多種腫瘤類型和8000多名患者，使用ROC和AUC來檢驗(yàn)多種生物標(biāo)志物，如PD-L1 IHC、腫瘤負(fù)荷(TMB)、基因表達(dá)譜(GEP)和mIHC/mIF在預(yù)測PD-1/PD-L1抑制劑療效方面的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，與其他三種檢測類型相比，mIHC/mIF檢測的預(yù)測準(zhǔn)確性最高（圖1）[4]。
圖1 不同生物標(biāo)志物與抗PD-1/PD-L1治療后患者反應(yīng)的相關(guān)性[4]
PART 02
mIHC/mIF的預(yù)后和預(yù)測價(jià)值實(shí)例
目前，已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室利用mIHC/mIF技術(shù)研究多種類型癌癥患者腫瘤組織內(nèi)免疫亞群的預(yù)后甚至預(yù)測價(jià)值。
Barua等人[5]利用mIHC方法對(duì)120例I-III期非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行分析，探討腫瘤微環(huán)境中肺癌細(xì)胞與特異性免疫細(xì)胞空間接近程度對(duì)預(yù)后的影響。該研究對(duì)CD8、CD4、Foxp3和CD68進(jìn)行標(biāo)記，然后利用一種新的G-cross空間距離分布方法分析每種細(xì)胞類型的豐度和空間位置以及它們彼此之間的接近程度，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)多元回歸分析淋巴細(xì)胞類型接近程度的影響。結(jié)果顯示（表1），腫瘤細(xì)胞與Foxp3+ Treg細(xì)胞相互作用的G-cross函數(shù)的曲線下面積(AUC)越大，經(jīng)年齡和陽性淋巴結(jié)數(shù)調(diào)整后的生存率越差(HR 1.52 (1.11-2.07)， P = 0.009)，表明在非小細(xì)胞肺癌中，核心腫瘤區(qū)域浸潤Treg細(xì)胞的增加是總生存率較差的獨(dú)立預(yù)測因子。然而，Treg-CD8的G-cross AUC越大，經(jīng)年齡和陽性淋巴結(jié)數(shù)調(diào)整后的生存率越高(HR 0.96 (0.92-0.99)，P = 0.042)，說明Treg細(xì)胞中CD8+毒性T細(xì)胞浸潤的增加能夠減輕這種效應(yīng)，并與更好的生存率顯著相關(guān)。
表1 G-cross AUC評(píng)分與臨床因素與總生存期的多因素Cox回歸分析[5]
T淋巴細(xì)胞比例為口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)患者的預(yù)后提供了信息。然而，尚未有研究同時(shí)評(píng)估HPV- OSCC腫瘤內(nèi)和腫瘤細(xì)胞附近免疫細(xì)胞的組成和位置，以及腫瘤免疫逃逸機(jī)制與臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)。因此，F(xiàn)eng等人[6]利用mIHC技術(shù)對(duì)119例 HPV- OSCC患者的腫瘤組織切片進(jìn)行CD3+、CD8+、FoxP3+、CD163+和PD-L1+細(xì)胞成像，然后評(píng)估這些marker與患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示（圖2），侵襲邊緣大量的CD8+ T細(xì)胞與延長的總生存期(OS)顯著相關(guān)，而FoxP3+或PD-L1+細(xì)胞的數(shù)量與預(yù)后不相關(guān)。在這個(gè)研究中，最引人注目的是CD8+ T細(xì)胞30 μm內(nèi)FoxP3+或PD-L1+細(xì)胞的數(shù)量，與靠近CD8+ T細(xì)胞的大量抑制因子和總生存期縮短顯著相關(guān)。
圖2 FoxP3+ T細(xì)胞、PD-L1+ T細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞的距離對(duì)預(yù)后的影響[6]
Johnson等[7]對(duì)來自10個(gè)腫瘤研究中心166名黑色素瘤患者（發(fā)現(xiàn)隊(duì)列，n = 24； 驗(yàn)證隊(duì)列，n = 142）在接受抗PD-1治療前的腫瘤活檢組織進(jìn)行多重?zé)晒馊旧?，選定的生物標(biāo)志物特征、PD-1/PD-L1相互作用評(píng)分和IDO-1/HLA-DR共表達(dá)被用來評(píng)估抗PD-1治療的結(jié)果。研究表明，發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中PD-1/PD-L1相互作用評(píng)分和/或IDO-1/HLA-DR共表達(dá)與抗PD-1治療反應(yīng)密切相關(guān)(P = 0.0005)。相比之下，單獨(dú)的生物標(biāo)志物(PD-1, PD-L1, IDO-1, HLA-DR)與治療反應(yīng)或生存無關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證隊(duì)列中得到了重復(fù)：PD-1/PD-L1和/或IDO-1/HLA-DR相互作用高的患者更有可能產(chǎn)生反應(yīng)(P = 0.0096)，這些患者的無進(jìn)展生存期(HR = 0.36;P = 0.0004)和總生存率(HR = 0.39; P = 0.0011)也得到顯著改善。在所有患者中，80% PD-1/PD-L1和IDO-1/HLA-DR相互作用水平較高的患者對(duì)PD-1抑制劑有響應(yīng)(P = 0.000004)。相比之下，PD-L1的表達(dá)并不能預(yù)測生存率。
圖3 發(fā)現(xiàn)隊(duì)列(n = 24)中應(yīng)答者(R)和無應(yīng)答者(NR)候選生物標(biāo)志物特征的T檢驗(yàn)分析[7]
為了確定免疫微環(huán)境是否會(huì)對(duì)非小細(xì)胞肺癌的臨床結(jié)果產(chǎn)生影響，Mazzaschi等[8]對(duì)NSCLC患者PD-L1表達(dá)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)與nivolumab治療效果之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，該研究納入42例腺癌(ADC)和58例鱗狀細(xì)胞癌(SCC)的手術(shù)切除樣本以及26例接受nivolumab治療的晚期患者(13例ADC和13例SCC)的樣本進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)， 高密度的PD-1抑制受體低表達(dá)的CD8+淋巴細(xì)胞亞群與接受手術(shù)治療的NSCLC患者的總生存期呈正相關(guān)(OS: HR = 2.268; 95% CI, 1.056-4.871, p = 0.03)。此外，CD8+細(xì)胞中PD-1低表達(dá)是nivolumab治療患者的一個(gè)顯著特征，顯示出更長PFS (PFS: HR = 4.51;95% CI, 1.45-13.94, p = 0.004)。上述結(jié)果說明PD-1陰性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞庫對(duì)晚期NSCLC切除術(shù)患者的生存和免疫治療反應(yīng)具有積極影響。
圖4 Kaplan-Meier曲線顯示PD-1-to-CD8 (D, F)和CD8-to-CD3 (E, G)分別對(duì)免疫治療晚期NSCLC患者DFS (D, E)和OS (F, G)的預(yù)測作用[8]
PART 03
小結(jié)
在腫瘤免疫治療時(shí)代，雖然免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）改善了晚期惡性腫瘤患者的生存和預(yù)后，但復(fù)雜的耐藥機(jī)制限制了臨床療效，需要更準(zhǔn)確的預(yù)后和預(yù)測性生物標(biāo)志物。新興的mIHC/mIF技術(shù)使我們能夠更好地表征TME，提供腫瘤組織內(nèi)的免疫細(xì)胞亞群的含量和空間排列的全面信息，識(shí)別新的生物標(biāo)志物，將有助于更好地預(yù)測腫瘤免疫治療的臨床療效，揭示免疫治療藥物的作用機(jī)理，指導(dǎo)臨床用藥?？傊?，mIHC/mIF在癌癥免疫治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
PART 04
熙寧生物|精翰生物mIHC經(jīng)驗(yàn)
熙寧生物|精翰生物組織病理實(shí)驗(yàn)室mIHC平臺(tái)配備了高標(biāo)準(zhǔn)的徠卡Bond Rx全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)、Akoya PhenoImager全光譜成像系統(tǒng)以及Halo數(shù)字病理圖像分析平臺(tái)等重量級(jí)設(shè)備及分析系統(tǒng)，可提供自動(dòng)化，高質(zhì)量的mIHC研究全流程解決方案。從panel設(shè)計(jì)，panel驗(yàn)證，以及樣本檢測等方面提供全方位的支持?？蔀閺V大藥企提供高品質(zhì)的臨床前、臨床試驗(yàn)階段的組織樣本mIHC檢測。
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參考文獻(xiàn)：
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