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補(bǔ)體系統(tǒng)是天然免疫的重要部分，在病原體免疫監(jiān)測和維持組織穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。補(bǔ)體系統(tǒng)識別免疫復(fù)合物、受損細(xì)胞或病原微生物的分子信號，繼而觸發(fā)蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)。該級聯(lián)反應(yīng)由三條途徑組成，分別稱為經(jīng)典途徑（CP）、凝集素途徑（LP）和替代途徑（AP）。補(bǔ)體系統(tǒng)的過量激活或者失調(diào)可能導(dǎo)致一系列的疾病發(fā)生。
隨著Alexion研發(fā)的首款C5補(bǔ)體抑制劑Sorilis以及后續(xù)長效的C5補(bǔ)體抑制劑Ultomiris的成功，Apellis研發(fā)的首款C3補(bǔ)體抑制劑Empavel上市，諾華的IptacopanPNH適應(yīng)癥成功上市，并且近期開拓IgA腎病適應(yīng)癥，補(bǔ)體系統(tǒng)的藥物研發(fā)成為越來越熱的賽道。本文將對目前補(bǔ)體系統(tǒng)藥物研發(fā)的熱門靶點(diǎn)和相關(guān)適應(yīng)癥進(jìn)行盤點(diǎn)，并深入解析補(bǔ)體信號通路原理和分析方法，此外還會分享熙寧生物丨精翰生物在此信號通路全方位的藥效評估和臨床分析轉(zhuǎn)化研究檢測經(jīng)驗(yàn)。
PART 01
補(bǔ)體抑制劑藥物研發(fā)進(jìn)展
針對補(bǔ)體系統(tǒng)的過量激活開發(fā)了大量的補(bǔ)體信號通路關(guān)鍵分子的抑制劑，目前靶向C5、C3、C1S、Factor B等的抑制劑走在前列并已成功上市，適應(yīng)癥主要集中在PNH、 aHUS、myasthenia gravis等領(lǐng)域；同時(shí)隨著新藥研發(fā)的進(jìn)程，在一期二期臨床階段，靶向Factor D、MASP2補(bǔ)體系統(tǒng)的新型抑制劑也在快速推進(jìn)，部分補(bǔ)體系統(tǒng)的藥物研發(fā)見圖1，補(bǔ)體藥物研發(fā)正當(dāng)時(shí)。
圖1 補(bǔ)體抑制劑的研發(fā)進(jìn)展
PART 02
補(bǔ)體抑制劑作用機(jī)理和藥效學(xué)分析方法
如圖2所示，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活主要由三條路徑組成：
圖2 補(bǔ)體系統(tǒng)的三條激活路徑
經(jīng)典途徑（CP）
經(jīng)典途徑需要機(jī)體的抗體（通常為IgM，或者高度聚集的抗體）和特定的抗原形成復(fù)合物后啟動，首先被補(bǔ)體系統(tǒng)中的識別單位：包括C1q、C1r、C1s識別；然后通過活化單位：包括C2、C3、C4形成級聯(lián)反應(yīng)，最后由膜攻擊單位：包括C5、C6、C7、C8和C9，通過蛋白水解酶的作用形成C5b9復(fù)合物結(jié)合到細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜損傷破碎。
凝集素途徑（LP）
凝集素途徑由機(jī)體的甘露聚糖結(jié)合凝集素（Mannan-binding Lectin,MBL）或纖維膠凝蛋白（Ficolin，F(xiàn)CN）直接識別多種病原微生物表面的甘露糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖氨、巖藻糖等為末端糖基的糖結(jié)構(gòu)。MBL-MASP復(fù)合物與病原體表面糖結(jié)構(gòu)結(jié)合，使MASP-1、MASP-2被獨(dú)立地激活?；罨腗ASP2發(fā)揮其活性，裂解C4，所產(chǎn)生的C4b片段共價(jià)結(jié)合于病原體表面，通過與C2相互作用，使后者也被MASP2裂解，形成C3轉(zhuǎn)化酶C4b2a，繼之活化補(bǔ)體CP；活化的MASP1能直接裂解C3產(chǎn)生C3b，在fD和fP的作用下，形成C3轉(zhuǎn)化酶C3bBb或C3bBbP，并產(chǎn)生C5轉(zhuǎn)化酶C3bBb3b，激活補(bǔ)體LP, 最后由膜攻擊單位：包括C5、C6、C7、C8和C9，通過蛋白水解酶的作用形成C5b9復(fù)合物結(jié)合到細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜損傷破碎。
旁路途徑 （AP）
旁路途徑在正常生理情況下，機(jī)體的C3與B因子、D因子等相互作用，可緩慢的產(chǎn)生極少量的C3B和C3bBb（旁路途徑的C3轉(zhuǎn)化酶），但迅速受H因子和I因子的作用，不再能激活C3和后續(xù)的補(bǔ)體成分。
旁路途徑的激活在于激活物質(zhì)（例如細(xì)菌脂多糖、肽聚糖；病素感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞，痢疾阿米巴原蟲等）的出現(xiàn)。激活物質(zhì)的存在為C3b或C3bBb提供不易受H因子置換Bb，不受Ⅰ因子滅活C3b的一種保護(hù)性微環(huán)境，使旁路激活途徑從和緩進(jìn)行的準(zhǔn)備階段過渡到正式激活的階段。
當(dāng)C3被激活物質(zhì)激活時(shí)，其裂解產(chǎn)物C3b又可在B因子和D因子的參與作用下合成新的C3bBb。后者又進(jìn)一步使C3裂解。由于血漿中有豐富的C3，又有足夠的B因子和Mg2 ，因此這一過程一旦被觸發(fā)。就可能激活的產(chǎn)生顯著的擴(kuò)大效應(yīng)。有人稱此為依賴C3Bb的正反饋途徑，或稱C3b的正反饋途徑，激活效應(yīng)將持續(xù)擴(kuò)大, 最后由膜攻擊單位：包括C5、C6、C7、C8和C9，通過蛋白水解酶的作用形成C5b9復(fù)合物結(jié)合到細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜損傷破碎。
補(bǔ)體的三條信號通路可以由不同的物質(zhì)啟動激活，中間匯集到C3激活，形成C5、C6、C7、C8和C9級聯(lián)反應(yīng)，最終形成mC5b9復(fù)合物，使細(xì)胞膜損傷破碎。同時(shí)旁路途徑除了被脂多糖等激活外，經(jīng)典途徑和凝集素途徑的激活也會激活旁路途徑，產(chǎn)生顯著的擴(kuò)大效應(yīng)。三條補(bǔ)體激活信號通路既有區(qū)別，又深度關(guān)聯(lián)，在藥物研發(fā)實(shí)踐過程中體外藥效方法的特異性需要格外關(guān)注。
PART 03
CFB抑制劑和C3抑制劑的臨床藥效學(xué)分析方法解析
上市藥物Empaveli的藥物作用機(jī)理如圖3：靶向補(bǔ)體蛋白C3，阻斷C3進(jìn)一步活化，從而抑制補(bǔ)體信號通路的激活。由于C3蛋白的活化是經(jīng)典路徑，凝集素路徑和旁路途徑共有，Empaveli可以同時(shí)抑制三條補(bǔ)體激活信號通路，跟三條信號通路相關(guān)的活性分析方法均能夠表征其藥效。
圖3 Empaveli的藥物作用機(jī)理
從Empaveli披露的文獻(xiàn)信息，其藥效學(xué)檢測分析方法進(jìn)行了C3活性，CH50和AP50的檢測。
從Empaveli公布臨床前前的藥效學(xué)數(shù)據(jù)來看主要的依據(jù)是旁路途徑的溶血試驗(yàn)抑制效果。
圖4 Empaveli臨床藥效學(xué)數(shù)據(jù)
上市藥物Iptacopan為CFB抑制劑，作用于補(bǔ)體旁路途徑C3上游，其主要的藥效學(xué)方法如下圖5。
圖5 Iptacopan的臨床藥效學(xué)方法
PART 04
熙寧生物|精翰生物的補(bǔ)體系統(tǒng)臨床前和臨床藥效學(xué)分析服務(wù)
基于熙寧生物丨精翰生物臨床階段的補(bǔ)體信號通路藥效評估經(jīng)驗(yàn)，補(bǔ)體信號通路藥效學(xué)表征有以下難點(diǎn)：
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補(bǔ)體三條信號通路既有區(qū)別，又有關(guān)聯(lián)，在方法學(xué)開發(fā)和驗(yàn)證階段，需要引入EDTA/EGTA、C1q、MBL、CFB、C3/C5抑制劑分組等充分表征藥效學(xué)模型的特異性，對方法學(xué)和檢測結(jié)果進(jìn)行科學(xué)解讀；
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補(bǔ)體凝集素途徑的活躍程度存有較大的個(gè)體差異，補(bǔ)體旁路途徑的活躍程度有人種差異和性別差異，需要基于大樣品量的個(gè)體血清基質(zhì)對檢測結(jié)果進(jìn)行充分的解讀；
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補(bǔ)體信號通路涉及到的成分復(fù)雜，信號通路級聯(lián)反應(yīng)跨度大，個(gè)體差異較大，需要從多角度，多維度對方法學(xué)和數(shù)據(jù)進(jìn)行解讀，需要從生物標(biāo)志物水平，信號通路水平，細(xì)胞裂解水平進(jìn)行轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究；
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旁路途徑激活受到凝集素途徑和經(jīng)典途徑的影響，旁路途徑抑制劑具備更加廣譜的補(bǔ)體活性抑制作用，適應(yīng)癥選擇范圍更廣；凝集素途徑個(gè)體差異較大，建議基于凝集素途徑的活躍程度進(jìn)行患者篩選入排。
熙寧生物|精翰生物擁有豐富的基于人血清樣品進(jìn)行補(bǔ)體信號通路藥效學(xué)評估的方法開發(fā)、驗(yàn)證和樣品分析經(jīng)驗(yàn)，可提供補(bǔ)體激活信號通路中經(jīng)典途徑、凝集素途徑和旁路途徑的藥效學(xué)分析服務(wù)，包括WIESLAB信號通路水平，紅細(xì)胞裂解/腫瘤細(xì)胞裂解水平，補(bǔ)體生物標(biāo)志物ELISA水平全方面的臨床前轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究和臨床階段藥效生物分析服務(wù)， 歡迎后臺留言咨詢。
熙寧|精翰相關(guān)補(bǔ)體檢測項(xiàng)服務(wù)項(xiàng)和項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)（部分）如下表：
圖6 熙寧丨精翰補(bǔ)體藥效方法學(xué)庫
熙寧丨精翰補(bǔ)體藥效檢測項(xiàng)目和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究經(jīng)驗(yàn)（部分）如下圖：
經(jīng)典途徑細(xì)胞殺傷抑制
凝集素途徑激活的個(gè)體差異
旁路途徑激活性別差異
旁路途徑PNH患者的C3b沉積以及Iptacopan藥效相關(guān)性
對照藥物L(fēng)NP023
