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藥物靶點(diǎn)（drug target）是機(jī)體內(nèi)與藥物直接接觸結(jié)合以產(chǎn)生相互作用的生物分子，通常是蛋白質(zhì)，與特定的疾病過程內(nèi)在相關(guān)。藥物靶點(diǎn)可以分為受體、酶、離子通道、DNA、激素與生長因子等幾種類型。藥物分子通過作用于藥物靶點(diǎn)并調(diào)控靶點(diǎn)的生物學(xué)功能進(jìn)而發(fā)揮其作用。
為了評(píng)估藥物作用機(jī)制、劑量效應(yīng)和PK/PD特性，在抗體藥物研究和開發(fā)中，對(duì)人血清或血漿中游離形式靶點(diǎn)的準(zhǔn)確定量對(duì)于藥效學(xué)評(píng)價(jià)是至關(guān)重要的。
本文我們描述了①一種免疫耗竭藥物的方法，以準(zhǔn)確定量樣品中游離靶點(diǎn)的濃度。以及②一種免疫耗竭靶點(diǎn)有效解決基質(zhì)效應(yīng)&平行性的方法。
PART 01
雙特異性抗體藥物游離靶點(diǎn)的定量方法
典型LBA方法對(duì)游離靶點(diǎn)定量
大多數(shù)測(cè)定游離藥物靶點(diǎn)的方法都是基于捕獲試劑和抗體藥物競爭與靶點(diǎn)結(jié)合的原理。測(cè)試方法的特異性和對(duì)靶標(biāo)生物學(xué)的理解是建立可靠的游離靶標(biāo)分析方法的關(guān)鍵。
臨床前或臨床階段測(cè)定靶點(diǎn)可遵循以下先決條件：捕獲抗體或檢測(cè)抗體應(yīng)與藥物是否有競爭關(guān)系。
圖a 總靶點(diǎn)與游離靶點(diǎn)檢測(cè)方法對(duì)比
Total target：抗體對(duì)中兩個(gè)抗體與藥物均是非競爭關(guān)系。檢測(cè)抗體及捕獲抗體和藥物結(jié)合靶點(diǎn)的位點(diǎn)均是不相同的。
Free target：抗體對(duì)中有且只有一個(gè)與藥物是競爭關(guān)系。檢測(cè)抗體與藥物結(jié)合靶點(diǎn)的位點(diǎn)是相同的，而捕獲抗體與藥物結(jié)合靶點(diǎn)的位點(diǎn)是不同的；或捕獲抗體與藥物結(jié)合靶點(diǎn)的位點(diǎn)相同，而檢測(cè)抗體與藥物結(jié)合靶點(diǎn)的位點(diǎn)不同。
定量分析游離靶點(diǎn)所面臨的挑戰(zhàn)
· 基質(zhì)效應(yīng)
檢測(cè)中通過對(duì)樣品高度稀釋來減少未知來源的基質(zhì)干擾，但此方式會(huì)引起靶點(diǎn)-藥物復(fù)合物的解離并與檢測(cè)試劑結(jié)合，這可能導(dǎo)致對(duì)游離靶點(diǎn)的潛在高估。此問題有兩種解決方案：①開發(fā)較小稀釋倍數(shù)或不稀釋樣本的分析方法；②稀釋樣本并恰當(dāng)?shù)貓?bào)告結(jié)果。
如果可行，始終優(yōu)先考慮方案①。然而在未稀釋的樣本中消除基質(zhì)干擾是一項(xiàng)困難的工作，因?yàn)樯锘|(zhì)是復(fù)雜的，并且在血漿和血清中總蛋白濃度很高。
這里提供一種在未稀釋或較小稀釋的樣本中消除基質(zhì)干擾的思路，即使用不含內(nèi)源性分析物的血清/血漿制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，使標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本具有相同的基質(zhì)效應(yīng)，以解決基質(zhì)效應(yīng)問題。
獲得這種不含內(nèi)源性分析物的基質(zhì)最直接的方法是使用藥物將所有待測(cè)物耗竭掉，并避免耗竭后過量的藥物進(jìn)入基質(zhì)中。圖b.一種使用磁珠耗竭基質(zhì)中內(nèi)源性靶點(diǎn)的方法舉例。
這種方法可以有效的解決基質(zhì)效應(yīng)，但對(duì)操作要求較高，需要摸索各種試劑濃度。
圖b 一種使用磁珠耗竭基質(zhì)中內(nèi)源性靶點(diǎn)的方法
步驟簡述：
1）包被藥物的磁珠耗竭基質(zhì)中的靶點(diǎn)；
2）空磁珠耗竭過量的包被藥物（否則藥物會(huì)對(duì)靶點(diǎn)的檢測(cè)有抑制作用）；
3）獲得純化后的基質(zhì)（不含靶點(diǎn)，不含藥物），用于配制標(biāo)曲，從而獲得了與真實(shí)樣品組分相似的標(biāo)曲，解決了基質(zhì)效應(yīng)。
· 藥物-靶點(diǎn)分子復(fù)合物的解離
除稀釋樣品會(huì)造成對(duì)游離靶點(diǎn)的潛在高估外，另一個(gè)因素是，對(duì)于某些藥物，給藥后由于機(jī)體本身的代償機(jī)制，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生更多的靶點(diǎn)（total target顯著升高），以彌補(bǔ)給藥后靶點(diǎn)的虧損。由于藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物在檢測(cè)過程中處于動(dòng)態(tài)平衡轉(zhuǎn)化的狀態(tài)，導(dǎo)致方法檢測(cè)出從復(fù)合物中解離出來的靶點(diǎn)，使游離靶點(diǎn)被高估。
為了進(jìn)一步減少靶點(diǎn)從復(fù)合物中解離并在檢測(cè)中產(chǎn)生的附加效應(yīng)，可以在LBA分析之前，采用某些方式對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，以耗竭其中的藥物或藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物，從而提高游離靶點(diǎn)的檢測(cè)準(zhǔn)確性。
對(duì)于雙特異性抗體藥物，可利用其對(duì)另一靶點(diǎn)的第二特異性選擇性地耗竭藥物或藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物，對(duì)于單克隆抗體藥物，也可以使用靶點(diǎn)的非競爭型抗體耗竭藥物或藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物。如圖c.利用磁珠預(yù)處理樣品的方法定量測(cè)定游離靶點(diǎn)A。
圖c 利用磁珠預(yù)處理樣品的方法定量測(cè)定游離靶點(diǎn)A
步驟簡述：
1）利用抗藥物另一端的抗體(抗-抗靶點(diǎn)B)或靶點(diǎn)B去耗竭樣品體系中的藥物以及藥物-靶點(diǎn)A；
2）藥物耗竭后的游離靶點(diǎn)A用free target方式進(jìn)行檢測(cè)。
PART 02
按照以上方式對(duì)某雙特異性抗體藥物
游離靶點(diǎn)測(cè)定的簡單數(shù)據(jù)分享
注：處理前，同一個(gè)樣品經(jīng)過不同倍數(shù)的稀釋，濃度差異較大，基質(zhì)干擾較大。
處理后，同一個(gè)樣品經(jīng)過不同倍數(shù)的稀釋，濃度較為恒定，無基質(zhì)干擾。
PART 03
總結(jié)
使用耗竭待測(cè)靶點(diǎn)的空白基質(zhì)有效地解決了基質(zhì)效應(yīng)問題，同時(shí)可以允許使用較低的MRD減少了靶點(diǎn)與藥物的解離。
此外，通過耗竭樣品中游離藥物或藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物的方式可以對(duì)游離靶點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，調(diào)整捕獲試劑和樣品孵育時(shí)間可以大大減少靶點(diǎn)分子從藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物中解離的機(jī)會(huì)，從而減少對(duì)游離靶點(diǎn)的潛在高估。
此游離靶點(diǎn)的定量方法穩(wěn)健可靠、準(zhǔn)確、精確并且無基質(zhì)效應(yīng)，可應(yīng)用于臨床前或臨床階段項(xiàng)目的研究。
熙寧生物 | 精翰生物在大分子生物分析領(lǐng)域有多年的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)（單雙抗、細(xì)胞治療、基因治療和一些新型藥物）。對(duì)于有難度的挑戰(zhàn)性的方法學(xué)建立具備豐富經(jīng)驗(yàn)，技術(shù)過硬，響應(yīng)迅速，且在生物分析的同時(shí)，能從申辦方角度對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)性的分析，并于臨床需求進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，建立合規(guī)，科學(xué)，適用臨床需求的方法。歡迎大家后臺(tái)留言咨詢交流。
